Способ получения гетерополимера -оксимасляной и b- оксивалериановой кислот

 

Использование: изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения гетерополимера b - оксимасляной и b - оксивалериановой кислот, являющегося разрушаемым термопластичным полимерным материалом. Сущность изобретения заключается в следующем: культуру штамма - продуцента засевают в жидкую солевую среду, содержащую источники энергии и углерода. Ферментацию проводят при непрерывном перемешивании и аэрации культуры при 30^oС и pH 7,0. В качестве основных ростовых субстратов используют Н₂ и СО₂ или ацетат; в качестве дополнительного источника углерода и индуктора синтеза валериата - органические кислоты, валериановую или пропионовую. Добавление к растущей культуре микроорганизмов, лимитированной по азоту, органических кислот в зависимости от дозы добавки и времени культивирования позволяет получать гетерополимеры различного состава. Новым является использование в качестве штамма - продуцента бактерий Alcaligenes eutrophus SVB -5786, применение которого при подобранных концентрациях органических кислот и времени культивирования позволяет при существенном сокращении сроков ферментации до 32 - 58 час/ получать гетерополимер с широким диапазоном соотношений, входящих в него сополимеров - окси - бутирата и оксивалериата, на непищевых субстратах.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения гетерополимера -оксимасляной и -оксивалериановой кислот.

Известен способ получения гетерополимера оксимасляной и оксивалериановой кислот с использованием в качестве продуцентов мутантных штаммов Alcaligenes eutrophus, а в качестве основного ростового субстрата спиртов и дополнительного источника углерода и индуктора для синтеза валериата пропанола [1] Данный гетерополимер аналогично гомополимера -оксимасляной кислоты (полиоксибутиратата) является экологически чистым, биосовместимым и биодеградируемым термопластичным полимером и перспективен для применения в медицине, хирургии, фармакологии, легкой и пищевой промышленности. Соотношение мономеров в гетерополимере может варьировать, это вызывает изменения ряда базовых физико-химических свойств полимера (молекулярная масса, температура плавления, механическая прочность и пр.), т.о. возможность получения гетерополимеров открывает перспективы для направленного получения полимерных материалов с заданными свойствами [2,3] Известен также способ получения гетерополимера -оксимасляной и -оксивалериановой кислот при культивировании микроорганизмов при лимите азота в среде на валериановой кислоте или смеси масляной и валериановой кислот [4] Данные способы позволяют получать гетерополимер со следующим содержанием сополимеров: для окстибутирата 50-100 мол. для оксивалериата, соответственно, 50-0 мол.

Недостатком способов является использование дорогостоящего и дефицитного сырья и недостаточно широкий диапазон соотношений содержания сополимеров и гетерополимере.

Известен способ получения гетерополимера оксимасляной и оксивалериановой кислот с использованием в качестве продуцента мутантных штаммов Alcaligenes eutrophus NClB 11599, Н-16 АТСС 17699 в двухстадийной периодической культуре при лимите азота в среде. В качестве основного ростового субстрата служит глюкоза или валериановая кислота, или их смеси. На первом этапе в течение 24 ч происходит наращивание биомассы на среде, содержащей дрожжевой экстракт, полипептон, мясной экстракт и сульфат аммония. На второй стадии полученную биомассу ресуспендируют в жидкой среде, содержащей фосфаты, сульфат магния, микроэлементы и в качестве источника углерода 20 г/л глюкозы или валериата, либо их смеси. Культивирование продолжают в течение 48 ч при 30^оС и рН 7,0. В зависимости от скорости подачи основного ростового субстрата (глюкозы или валериата) соотношение сополимеров варьирует от 10 до 100 мол. для бутирата и от 90 до 0 мол. для валериата при общих затратах времени на ферментацию, равными 72 ч [5] Данный способ является прототипом изобретения.

Недостатком прототипа является использование дорогостоящего, в том числе пищевого сырья, а также длительность ферментации.

Цель изобретения использование непищевого сырья, т.е. снижение затрат и расширение сырьевой базы, а также сокращение сроков ферментации.

Цель достигается в результате использования в качестве продуцента штамма Alcaligenes eutrophus ВКМП В-5786, способного синтезировать гетерополимер с различным соотношением оксибутирата и оксивалериата на различных, в том числе на непищевых субстратах.

Суть предлагаемого способа заключается в следующем. Музейную культуру штамма-продуцента засевают в жидкую солевую среду, содержащую в качестве основного ростового субстрата смеси водорода и двуокиси углерода или соли уксусной кислоты, и в качестве индуктора синтеза оксивалериата добавки валериановой или пропионовой кислот. Культивирование проводят при лимите азота в периодической культуре при 30^оС и рН 7,0 в одну стадию. В зависимости от дозы подаваемой кислоты и времени ферментации соотношение оксивалериата и оксибутирата в получаемом гетерополимере варьирует в широких пределах.

П р и м е р 1. Музейную культуру штамма-продуцента Alcaligenes eutrophus ВКПМ В-5786 суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей, г/л: Na₂HPO₄ 9H₂O 9,5 KH₂PO₄ 1,5 MgSO₄ 0,2 NH₄Cl 0,3, а также 5 мл раствора железа лимоннокислого (5 г/л) и 3 мл стандартного раствора микроэлементов, содержащего, г/л: H₃BO₃ 0,228 CoCl₂ 6 H₂O 0,030 CuSO₄ 5 H₂O 0,008
MnCl₂ 4 H₂O 0,008
ZnSO₄ 7 H₂O 0,176
NaMoO₄ 2 H₂O 0,008
NiCl₂ 0,008
Ферментацию проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 0,5 л, которые заполняются культурой на 0,1 л. Колбы устанавливаются в термостатируемом шкафу на качалку и соединяются герметично с емкостью, содержащей в качестве основного ростового субстрата газовую смесь водорода и двуокиси углерода, а также кислород, которая поступает в колбы через систему микробиологических фильтров и шлангов. Содержание компонентов в смеси, об. водород 70; кислород 20; двуокись углерода 10. Культивирование проводят в течение 16 ч при 30^оС и рН 7,0 при периодическом (через 4-6 ч) обновлении газовой смеси в колбах до получения урожая 0,7 г/л по сухому веществу. Далее в растущую культуру вносят добавку валериановой кислоты из расчета 2 г/л; ферментацию продолжают в заданных условиях еще 14 ч. Полученный гетерополимер содержит 47 мол. оксибутирата и 53 мол. оксивалериата; затраты времени на ферментацию составляют 30 ч.

П р и м е р 2. Культивирование штамма-продуцента проводят как в примере 1. Время культивирования после добавки валериановой кислоты составляет 40 ч, общее время ферментации 56 ч. Содержание сополимеров в гетерополимере (в мол.) оксибутират 31, оксивалериата 69.

П р и м е р 3. Культивирование проводят как в примере 1. Время культивирования штамма-продуцента после добавки валериановой кислоты составляет 45 ч, общее время ферментации 61 ч. Полученный гетерополимер содержит (в мол.): оксибутирата 50, оксивалериата 50.

П р и м е р 4. Культивирование штамма-продуцента проводят как в примере 1. После первой добавки валериановой кислоты в концентрации, равной 2 г/л, культивирование продолжают 8 ч, после этого вносят вторую добавку валериановой кислоты в той же концентрации, культивирование продолжают еще 16 ч. При общих затратах на ферментацию 40 ч гетерополимер содержит (в мол.) оксибутирата 35, оксивалериата 65.

П р и м е р 5. Культивирование проводят как в примере 4 с двумя добавками валериановой кислоты. Время культивирования после второй добавки кислоты составляет 24 ч, общее время ферментации 48 ч; полученный гетерополимер содержит (в мол.) оксибутирата 22, оксивалериата 78.

П р и м е р 6. Культивирование проводят как в примере 1. Однако в качестве добавки для синтеза оксивалериата используют вместо валериановой кислоты пропионовую. В 16-часовую культуру штамма-продуцента с концентрацией клеток 0,7 г/л вносят пропионовую кислоту в концентрации 2 г/л; ферментацию продолжают в течение 16 ч. Общее время культивирования 32 ч, содержание сополимеров в гетерополимере следующее (в мол.): оксибутират 43, оксивалериата 57.

П р и м е р 7. Культивирование штамма-продуцента проводят как в примере 1, но в качестве основного ростового субстрата используют уксуснокислый натрий, который вносят в состав солевой среды в концентрации 5 г/л. Культивирование проводят в режиме рН-статирования с использованием для коррекции рН 0,7 М раствора уксусной кислоты. В 8-часовую культуру при концентрации клеток, равной 0,3 г/л, вносят добавку валериановой кислоты в концентрации 0,4 г/л; ферментацию продолжают еще 30 ч. Полученный гетерополимер содержит (в мол.): оксибутирата 33, оксивалериата 67, общее время ферментации 38 ч.

П р и м е р 8. Культивирование проводят как в примере 6, но в качестве индуктора синтеза оксивалериата используют смесь масляной и валериановой кислот, которые вносят в 16-часовую растущую культуру. Концентрация кислот из расчета по 2 г/л для каждой, культивирование продолжают в течение 40 ч. Общее время ферментации 56 ч, содержание сополимеров в гетерополимере (в мол.) следующее: оксибутират 20, оксивалериат 80.

П р и м е р 9. Культивирование проводят на среде и при параметрах как в примере 1, используя 50-литровый ферментер, снабженный перемешиванием и рН-статированием. Объем культуры 10 л. Газовая смесь, содержащая водород, кислород и двуокись углерода в соотношении, равным по объему 7; 2; 1, непрерывно с помощью компрессора прокачивается через культуру со скоростью 8 л/мин л. При получении урожая, равному 5 г/л (20-часовая культура), в ферментер вносят добавку валериановой кислоты из расчета 2 г/л; ферментацию продолжают в течение 6 ч. Полученный гетерополимер содержит(в мол.) оксибутирата 8, оксивалериат 92 при общих затратах времени на ферментацию 26 ч.

П р и м е р 10. Культивирование проводят как в примере 9. Время культивирования после добавки валериановой кислоты составляет 18 ч, общее время ферментации 38 ч. Полученный гетерополимер содержит (в мол.) оксибутирата 40, оксивалериата 60.

Предложенный способ позволяет при использовании непищевого доступного сырья получать гетерополимер с широким диапазоном соотношений оксибутират-оксивалериат при сокращении времени на ферментацию в целом.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОПОЛИМЕРА -ОКСИМАСЛЯНОЙ И b-ОКСИВАЛЕРИАНОВОЙ КИСЛОТ, заключающийся в культивировании штамма-продуцента в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей ростовой субстрат с добавлением валериановой или пропионовой кислоты при лимите азота, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Alcaligenes eutrophus ВКПМ В-5786, а ростового субстрата - водород и двуокись углерода или соли уксусной кислоты.