Способ получения сериновой протеазы, штамм щелочефильных bacillus-продуцент сериновой протеазы

 

Использование: микробиологический способ получения фермента, а именно получение сериновой протеазы рекомбинантной технологией. Сущность изобретения: способ получения сериновой протеазы предполагает культивирование штамма щелочефильных Bacillus РВ 92, трансформированных рекомбинантной плазмидой ДНК pMAX 4, выделение и очистку целевого продукта. Трансформацию штамма осуществляют путем обработки штамма лизоцимом в щелочной среде при 20 - 37°С, отделения образовавшихся протопластов от лизоцима, объединения протопластов с рекомбинантной плазмидной ДНК при той же температуре в присутствии реагента для смещения, регенерации клеток штаммов и выращивания регенерированных клеток в селективных условиях. 1 табл., 2 ил.

Изобретение относится к получению сериновой протеазы Bacillus c применением технологии рекомбинантных ДНК.

Бактериальные сериновые протеазы могут быть получены из многих прокариотических организмов, включая грамотрицательные организмы, такие как виды Serratia или Pseudomonas, и грамположительные бактерии, такие как виды Micrococcus и Bacillus. В группу промышленно важных сериновых протеаз, представляющих исключительный интерес, входят те протеазы, которые имеют высокую активность в щелочных средах. В то время как промышленные сериновые протеазы вырабатываются различными видами, включая B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. alcalophilus и другие виды Bacillus, высокощелочные протеазы в основном вырабатываются штаммами Bacillus, которые способны к росту при щелочном рН. Примером такой бациллы служит Bacillus novo species PB 92.

Существует значительный интерес к разработке штаммов бацилл, способных вырабатывать протеолитические ферменты с большим выходом, в частности высокощелочные протеазы.

Были успешно клонированы гены, кодирующие сериновую или щелочную протеазу B. subtilis (Wong et. al., Proc. Natl Acad. Sci USA 81, 1984, 1184), B. licheniformis (Jacols et. al. Nucleic Acids Res. 13, 1985, 8913) и B. amyloliquefaciens (wells et. al. Nucleic Acids Res 13, 1985, 8913) и B. amyloliquefaciens (wells et. al. Nucleic Acids Res, 11, 1983, 7911).

Производство промышленных сериновых протеаз в различных видах Bacillus известно из патентов США NN 3674643; 3723250 и 4480043. Производство высокощелочного протеолитического фермента в штаммах Bacillus, способных к росту при щелочном рН, описано, например, в патентах США NN 3723250; Re 30602 и 4480037.

Удобный вектор для трансформации клетки Bacillus включает структурный ген, кодирующий высокощелочную протеазу, получаемый щелочефильной Bacillus, содержащей контролирующие районы, такие как последовательность промотора, последовательность, образующая участок связывания с рибосомами, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции гена щелочной протеазы, причем перечисленные контролирующие участки являются функциональными в хозяйской клетке щелочефильной Bacillus.

Кроме того, вектор может содержать маркерный ген, например, для придания устойчивости к антибиотику, к которому хозяйский штамм чувствителен (особый интерес представляет устойчивость к неомицину), и origin репликации, который способен автономно реплицироваться в хозяйской клетке. Origin репликации может быть таким, который имеет мутацию, делающую его функционирование в хозяйской клетке температурочувствительным, таким образом обеспечивая селекцию на хромосомальное встраивание.

Для производства высокощелочной протеазы предпочтительной последовательностью ДНК для использования в трансформации штаммов Bacillus, которые продуцируют сериновую протеазу, является последовательность, полученная из Bacillus novospecies PB 92. Аминокислотная последовательность сериновой протеазы, кодируемая указанной последовательностью ДНК, следующая: 15 H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- 20 S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S- M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.

Хотя предпочтительным штаммов для обеспечения гена протеазы является вид Bacillus PB 92, такая же сериновая протеаза может быть получена из других щелочефильных бацилл. Гены протеаз - гомологичные по крайней мере на 70% и предпочтительно свыше 80% к гену Bacillus PB 92.

Желательно, чтобы продукт эксперсии секретировался. Так как щелочная протеаза секретируется, могут быть использованы секреционные лидерные сигналы и сигналы процессинга дикого типа. Кроме того, может быть получен слитый ген путем придания 5' -последовательности структурному гену, кодирующему секреторный лидерный сигнал и сигнал процессинга. Характерные гетерологичные секреторные лидерные последовательности включают секреторные лидерные последовательности генов амилазы и протеазы Bacillus. В зависимости от того, желательно ли встраивание структурального гена в хромосому хозяйского штамма либо поддержание его во внехромосомальном элементе, репликационная система Bacillus может быть включена или нет. С целью встраивания участки гомологии плазмидной конструкции с геномом Bacillus могут быть использованы для увеличения вероятности рекомбинаций. Более того, включение в плазмидную конструкцию температурочувствительного origin репликации позволяет проводить селекцию по хромосомальному встраиванию. Для увеличения экспрессии структурного гена в хозяйскую клетку может быть вставлено более одной копии структурного гена. Стабильная амплификация структурного гена может быть получена встраиванием по крайней мере одной добавочной копии структурного гена с геном хозяйской клетки и отбором трансформантов, в которых копии структурного гена разделены эндогенными хромосомальными последовательностями. Конструкции ДНК и способы для прокариотических систем известны из заявки N ЕР-А-87200356.

В качестве хозяина для трансформации может быть использован любой штамм Bacillus, однако при выборе подходящего штамма учитываются факторы, которые могут улучшить продукцию высокощелочных протеаз. Продукция может быть улучшена различными путями, включая хозяина, в котором снижена деградация желаемого продукта, узнавание регуляторных сигналов, облегчение секреции и т. д. Таким образом, хотя предпочтительным хозяином Bacillus является продуцент высокощелочной протеазы, в качестве хозяина также может быть использован мутант, который сам по себе не вырабатывает высокощелочную протеазу.

Бациллы, продуцирующие высокощелочную протеазу, таксономически недостаточно классифицированы и их обычно относят к щелочефильным штаммам Bacillus. Примеры штаммов Bacillus, способных расти при щелочном рН, известны из патентов США NN 3723250, Re 30602 и 4480037. Примером предпочтительного хозяйского штамма щелочефильного Bacillus является штамм Bacillus novo species PB 92, раскрытый наряду с другими в патенте США N Re 30602.

Промышленные штаммы щелочефильных Bacillus могут также быть использованы в качестве хозяйских клеток. Для промышленных штаммов Bacillus характерна устойчивость к генетическому обмену, такому как фаговая инфекция или трансформация. Эти штаммы стабильны и трансформанты могут быть или не быть способными к образованию cпор. Они обычно фототрофы и модифицированы для обеспечения высоких выходов эндогенных белковых продуктов, таких как альфа-амилаза и различные протеазы. Выход эндогенного белкового продукта, полученный в процессе промышленного производства, может доходить по крайней мере до 5 г/л/0,5% ( объем/вес ). Промышленные штаммы также секретируют ДНК-азы, которые приводят к деградации ДНК в среде, обеспечивая защиту от генетического обмена.

Трансформация щелочефильных штаммов Bacillus преимущественно включает использование протопластов упомянутых штаммов. Однако обычный способ трансформации протопласта не работает для щелочефильных штаммов Bacillus. Следовательно, должны быть разработаны дополнительные способы.

Для щелочефильных бацилл образование и регенерация протопластов может происходить при высоком рН, предпочтительно около рН 8. Протопласты могут быть приготовлены ресуспендированием клеток в щелочной буферной среде (АНМ - alkaline holding medium) pH 7,8-8,5 c последующей инкубацией в течение 30-80 мин при 37^оС. В качестве примера АНМ см. пример 5. Полученные протопласты затем промываются для удаления лизоцима, затем ресуспендируются в АНМ. Далее в присутствии подходящего реагента для слияния, плазмидная конструкция и протопласт щелочефильного хозяина Bacillus объединяются. Хотя может быть использован любой реагент для слипания, который обеспечивает желаемую эффективность, обнаружено, что полиэтиленгликоль молекул веса 1000-8000 в значительной мере обеспечивает высокую эффективность слияния. Протопласты, приготовленные из акцепторного штамма Bacillus, смешиваются с плазмидной конструкцией в течение не более 5 мин, желательно не дольше 2 мин в присутствии полиэтиленгликоля. Смесь реагентов для слияния затем меняется обычной питательной средой, в которой клетки инкубируются в течение до 5 ч, предпочтительно 2-3 ч, перед переносом на регенерирующие чашки. Регенерирующие чашки содержат антибиотик, такой как неомицин, для отбора трансформантов.

Клоны с эписомальным поддерживанием конструкции ДНК могут быть идентифицированы путем обнаружения эксперссии высокощелочной сериновой протеазы. Для идентификации тех клонов, которые содержат экспрессирующую конструкцию в виде участка, встроенного в их хромосомы, клоны, которые получаются, скринируются путем выделения суммарной клеточной ДНК и отбора клонов, в которых может быть обнаружена свободная плазмидная ДНК, но маркерный ген плазмиды экспрессируется. Эти клоны затем можно скринировать подходящими способами для обнаружения экспрессии высокощелочной сериновой протеазы.

Различные методы обнаружения, включая использования специфических антител, ДНК- или РНК-гибридизацию, образование ферментного продукта или использование ферментного субстрата могут быть использованы для скринирования клонов с целью обнаружения присутствия экспрессирующей конструкции и экспрессии интересующего структурного гена, а именно производства протеазы. Производимая протеаза может быть охарактеризована биохимически, например, определением молекулярного веса протеазы с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, электрофореза в гис-тидин-MOPS геле и определением кинетических параметров K_m и V_max, определяемых на синтетическом субстрате suecinyl-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitro-analide.

Хозяин Bacillus, содержащий экспрессирующую конструкцию, включенную эписомально или хромосомально, затем выращивается на питательной среде в условиях, благоприятствующих синтезу фермента. Питательная среда обычно включает средства для поддержания плазмиды, такие как присутствие антибиотика, к которому чувствителен нетрансформированный хозяин. Ферментация может продолжаться пока не истощится бульон. Там, где продукт секретируется, он может быть выделен из бульона удобным способом, например экстракцией, хроматографией, электрофорезом или т.п. Там, где продукт остается в цитоплазме, клетки могут быть собраны центрифугированием, фильтрацией и т.д., лизированы механическим перетированием, детергентом, лизоцимом или другими методами и продукт может быть выделен, как описано ранее.

Когда нетрансформированная хозяйская клетка является продуцентом высокощелочной протеазы, посредством представленного метода могут быть достигнуты сильно увеличенные выходы высокощелочной сериновой протеазы, обычно по крайней мере 120% по сравнению с выходом в нетрансформированной хозяйской клетке с единственной внехромосомной копией гена.

На фиг.1 показаны результаты гистидин/MOPS гельэлектрофореза, проведенного с суспернатантами культур B. subtilis DB104, содержащими соответственно pUB110 и рМ 58 в сравнении с некоторыми субтилизации: 1 дорожка: субтилизин Carlsberg; 2 дорожка: протеаза Bacillus PB 92; 3 дорожка: субтилизин Bacillus subtilis; 4 дорожка: Bacillus subtilis ДВ 104 (рМ 58); 5 дорожка: Bacillus subtilis ДВ 104 (рИВ 110); на фиг. 2 - рестрикционная карта плазмиды рМ 58: в верхней части показана стратегия секвенирования. Сплошные линии со стрелками представляют фрагменты, клонированные в векторах mp 10, mp 11 и mp 13 фага М 13, в нижней части - стратегия сиквенирования с использованием 10 олигонуклеитидов, локализованных через равные промежутки на гене протеазы.

Нуклеитидная последовательность кодирующей цепи, соотнесенная с аминокислотной последовательностью сериновой протеазы Bacillus PB 92, показана ниже. Также показаны промоторы (Р₁Р₂), сайт связывания рибосом (rbs) и районы терминации (term). последовательности ДНК. Пронумерованные сплошные линии представляют место размещения десяти олигонуклеитидов, использованных для секвенирования (см.табл.1).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Приготовление библиотеки геномной ДНК из щелочефильного нового вида Bacillus PB 92 и выделение гена сериновой протеазы.

Громосомальная ДНК, выделенная из Bacillus novo sp. РВ 92 (хранится под N OR-60 в лаборатории микробиологии, Технический университет Дельфта, Нидерланды; патент США N Re 30602), была частично переварена рестрикционным ферментом San 3A и лигирована в Bam HI сайт плазмиды рИВ 110 (Gryczan et al., Y. Bacteriol 134, 1978, 313-329). Плазмида ДНК рИВ 110 была приготовлена как описано Birnoboim и Doly (Nucl. Acids Res, 7, 1979, 1513-1523).

Лигирующую смесь трансформировали в B. subtilis IA40. Генетический центр хранения бацилл по способу Spizizen et. al., I. Bacteriol 81 (1961) 741-746, используя 0,6-1 мкг ДНК на мл компетентных клеток. Клетки из трансформационной смеси высеивали на минимальные чашки, содержащие 2,8% K₂HPO₄, 1,2% KH₂PO₄, 0,4% (NH₄)₂SO₄, 0,2% три-Na-цитрат 2Н₂О; 0,04% MgSO₄ 7H₂O; 0,00005% MnSO₄ 4H₂O, 0,4% L-глутаминовой кислоты, 0,5% глюкозы, 0,02% казаминовых кислот, 50 мкг/мл триптофана, 20 мкг/мл метионина, 20 мкг/мл лизина, 20 мгк/мл неомицина, 0,4% казеина и 1,5% агара. После инкубации чашек в течение ночи при 37^оС одна из 50000 колоний, устойчивых к неомицину, показала возросшую продукцию протеазы, что определили по увеличению преципитации ореола продуктов расщепления казеина вокруг колоний на пластинке агара. Плазмидная ДНК была выделена из этой колонии по способу, описанному birnboim и Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523 и обозначена рМ 58.

П р и м е р 2. Экспрессия гена сериновой протеазы РВ 92. Bacillus subtilis IA40, содержащая рМ 58, была выращена на минимальной среде (Spizizen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 44 (1958) 1072-1078), к которой было добавлено 0,02% казаминовых кислот, 50 мкг/мл триптофана, 20 мкг/мл метионина, 20 мкг/мл лизина и 20 мкг/мл неомицина. Через 24 ч культуру центрифугировали и суспернатант проверяли на протеазную активность, используя в качестве субстрата диметилказеин Line et al., I. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. Культура B. subtilis IA40, содержащая плазмиду рИВ 110, использованная в качестве контроля, показала меньше 1/60 протеазной активности, показанной культурой, трансформированной рМ 58. Протеазная активность полностью ингибировалась обработкой 1 мМ фенилсульфанилфлуоридом (РМ SF), но не 20 мМ ЭДТА.

Аликвоты супернатантов анализировались с помощью белкового геля по способу Laemmli, Nature 227 (1970) 680. Пробы для анализа на этих гелях были приготовлены обработкой супернатантов 5% -й трихлоруксусной кислотой (ТХУ). После центрифугирования образца осадок препитированного белка промывался дважды ацетоном, затем растворялся в 40 мкл буфера для образцов (0,5 М трис/HC pH 7,5; 10 об.% 2-меркаптоэтанола; 50 об.% глицерина и 0,05% бромфенолового синего) при кипячении в течение 10 мин. После электрофореза гели окрашивали, используя Кумасси бриллиантовый синий. Затем пробы супернатанта культур анализировались электрофорезом. Использовались три разных штамма B. subtilis IA40: штамм, содержащий рИВ 110, или рМ 58, или без плазмиды и протеаза Bacillus РВ92 в качестве контроля. После электрофореза гели окрашивали, используя Кумасси бриллиантовый синий, и отмывали. Образец из B. subtilis штамма IA40, содержащего рМ 58, включал белок весом 31 кДа, который мигрирует совместно с протеазой Bacillus PB92. Этот белок не обнаруживался в контрольной дорожке штамма B. subtilis IA40, содержащего рИВ 110.

Все сериновые протеазы имеют одинаковый молекулярный вес. Поэтому клонированная сериновая протеаза Bacillus PB 92 дифференцировалась от известных сериновых протеаз субтилизина B. subtilis, cубтилизина Carlsberg c помощью трансформации РМ 58 и ИВ 110 в беспротеазный штамм B. subtilis ДВ 104 (R. Doi, I. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) и анализа продуцируемой внеклеточной протеазы. Полученные трансформанты выращивались на минимальной среде (Spizizen et. al.), содержащей 0,02% казаминовых кислот, 50 мкг/мл гистидина и 20 мкг/мл неомицина. Через 24 ч были взяты образцы, центрифугированы и без дополнительной обработки анализированы с помощью гистидин/MOPS гелей, содержащих 75 мМ КОН; 40 мМ гистидин; 100 мМ MOPS [3-(11-морфолино)-пропансульфоновая кислота] , pH 7,5 и 5% полиакриламид. Электрофоретический буфер содержал 40 мМ гистидина, 100 мМ MOPS, pH 6,6. Образцы двигались по направлению к катоду. Полосы протеазы обнаруживались с помощью профессиональных пленок Agfa Pan 100. (Zuidweg et al., Biotechnol и Bioengin 14, 1972, 685-714). Эти результаты показаны на фиг.1. Как показано, рМ 58 несет ген, кодирующий протеазу Bacillus PB 92.

П р и м е р 3. Секвенирование гена сериновой протеазы Bacillus PB 92.

Полная последовательность BalIHpa1 фрагмента рМ 58 определена способом Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, 6469. Рестрикционные фрагменты рМ 58 (фиг. 2) были клонированы в векторах mp10, mp11 и mp18 фага М13 (Messing et. al., Nucleiе Acids. Res. 9, 1981, 309-321). Встраивания фрагментов м58 скринивали с помощью гибридизации бляшек. После секвенирования были сделаны десять олинонуклеотидов, локализованных через равные промежутки на гене, и было повторено секвенирование, которое подтвердило нуклеитидную последовательность кодирующей цепи.

П р и м е р 4. Конструирование плазмиды рМАХ-4, содержащей сериновую протеазу.

Для конструирования плазмиды pUCN 710 рИВ 110 была переварена TaqI и PVU II. Фрагмент, содержащий ген, придающий устойчивость к неомицину, был очищен с помощью низкоплавкой агарозы и затуплен полимеразой Кленова и НТФ (Matiatis, Molecular Cloning: A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Плазмида рИС7 (Vieira et. al. Gene 19, 1982, 259-268) была линеаризована Sal 1 и затуплена, как описано выше. Оба фрагмента были лигированы Т4 лизазой (Maniatis) и трансформированы в E. Coli YMl 03. Отбор вели на 2хТV чашках (1,6 мас.%) объем бактотриптона; 1 мас.% (объем дрожжевого экстракта; 0,5% NaCl), cодержащих 50 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл неомицина. Полученная плазмида, названная pиСN 710, была переварена BamHT. Плазмида PEl 94 (Lordanescu, Plasmid1, 1978, 468-479) была переварена BCl 1. Фрагменты из обоих расщеплений были лигированы Т4 лигазой и трансформированы в Subtilis IA40. Отбор вели на минимальных чашках, содержащих 20 мкл/мл неомицина.

Субклонирование гена протеазы в вектор встраивания вели следующим образом: pM 58 (см. пример 1) переваривали Нра 1 и Bal 1 и Bgl 11. Плазмиду рЕ 194-neo переваривали Нра 1. Эти фрагменты лигировали Т4 лигазой и трансформировали в S. subtilis IA40. Трансформанты отбирали на основе устойчивости к неомицину и увеличения продукции протеазы, о чем судили по преципитации продуктов расщепления казеина (образование ореола, см. пример 1). Была получена плазмида рМАХ-4, структура которой подтверждена анализом рестрикционными фрагментами.

П р и м е р 5. Трансформация протопласта штамма Bacillus PB 92 pMAX-4.

Штамм Bacillus PB 92 растили в течение ночи в 100 мл NBS 6-X cреды (Thorne et. al., I. Bacteriol, 91, 1966, 1012-1020). Культуру центрифугировали в течение 10 мин при 4500 об./мин в роторе Sorvall модель GSA. Протопласты были приготовлены инкубированием бацилл в течение часа при 37^оС в 10 мл щелочной среды (АНМ), содержащей 0,5 М сахарозы; 0,02 М Mg Cl₂ и 0,02 М Трис/малеат, рН 8,0, в стерильной воде, к которой было добавлено 0,4 мг/мл лизоцима. Протопласты были осаждены 10 мин при 4500 об./мин, ресуспендированы в 5 мл буферной смеси АНМ рН 8,0 (АНМ-буфер, к которому добавлено 3,5 мас. % /объем Бакто Penassay бульона и 0,04 мас.%/объем Merieux альбумина), перемешаны, затем переосаждены. После ресуспендирования в 5,0 мл АНМ 0,5 мл этой суспензии протопластов было смешано с 5 мкг деминерализованной воды, содержащей 1 мкг плазмидной ДНК, и инкубированы в течение 2 мин в присутствии 30 мас.%/объем полиэтиленгликоля 8000, рН 8,0. После трехкратного разбавления средой АНМ⁺ рН 8,0 и центрифугирования осадок ресуспендировали в малом объеме 1 мл АНМ⁺ и инкулировали в течение 2-3 ч. Аликвоты по 100 мкл были высеяны на свежеприготовленные регенерационные чашки, содержащие 0,5 М сукцината Na/HCl, рН 8,0; 1,5 мас.%/объем агара; 0,5 мас.%/объем казаминовых кислот; 0,5 мас.%/объем дрожжевого экстракта; 0,031 м фосфатного буфера, рН 8,0; 0,5 мас.%/объем глюкозы; 0,02 Mg Cl₂ и 0,02 мас.%/объем Merieux альбумина. Эти чашки также содержали 1000 мкг/мл неомицина для селекции. После инкубации при 37^оС в течение по крайней мере 72 ч колонии были перенесены на чашки с агаром, содержащим сердечный экстракт и 20 мкг/мл неомицина.

П р и м е р 6. Встраивание рМАХ-4 в хромосому штамма Bacillus PB 92.

Колония штамма Bacillus PB 92, содержащего рМАХ-4, выращенные на чашке с агаром, содержащим сердечный экстракт и 20 мкг/мл неомицина, была внесена в 100 мл траптонного соевого бульона, содержащего 1 мкг/мл неомицина, и инкубирована в течение 24 ч при 37^оС. 2 мл культуры (приблизительно 10⁹ кл. /мл) разводили в 100 мл той же среды, содержащей 1 мкг/мл неомицина, и инкубировали в течение 24 ч при 50^оС. Через 24 ч 5 мл культуры (приблизительно 10⁹ кл./мл) развели снова и инкубировали в течение 24 ч при 50^оС в присутствии 1 мкг/мл неомицина. Последняя процедура была повторена еще раз. Затем клеточная суспензия была разведена в 100 раз и высеяна на чашки с агаром, содержащим сердечный экстракт (И1-агар, Difco), 1 мкг/мл неомицина. Чашки инкубировали в течение 16 ч при 50^оС. Колонии, устойчивые к неомицину, были изолированы и культивировались в 10 мл среды TSB, содержащей 1 мкг/мл неомицина, в течение 16 ч при 37^оС. Из этих культур была выделена суммарная ДНК (Holmes et. al., Anal. Bichem. 114, 1981, 198-197), и с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле проверена на отсутствие плазмиды. Образцы, в которых не обнаруживалась плазмидная ДНК, были перепроверены с помощью трансформации суммарной ДНК в B. sublitis IA40. Образцы, лишенные способности трансформировать subtilis IA40, считались свободными от плазмиды.

Устойчивый к неомицину, свободный от плазмиды, полученный из Bacillus PB 92 штамм был найден и назван РВТ 109. Этот штамм содержал копию плазмиды РМАХ-4, встроенной в его хромосому. Встраивание в штамм РВТ 109 происходило по так называемому механизму Camplell путем гомологичной рекомбинации, приводящей к двум тендемно расположенным генам протеазы на хромосоме, разделенным плазмидными последовательностями. Эта генетическая организация штамма РВТ 109 была подтверждена, как показано в совместном ЕРА-0000000.

П р и м е р 7. Протеазная продукция трансформированных штаммов.

Протеазная продукция трансформированных штаммов была тестирована добавлением 0,2 мл культуры TSB, содержащей приблизительно 10⁹ кл./мл, в 500 мл качалочные колбы, содержащие 100 мл продукционной среды, описанной в патенте США N Re 30602. Однако при тестировании штаммов B. subtilis pH был доведен до 7,0. Неомицин добавляли в концентрации 20 мкг/мл для штаммов DB 104 (p. ИВ 110), DB 104 (pMAX-4), PB 92 pMAX-4 в концентрации 1 мкг/мл для РВТ 109. Относительная продукция протеазы для этих клеточных линий показана в табл.2.

При ферментации в 10 л Bacillus PB 92 pMAX-4 обнаружили нестабильность и уменьшение продукции по сравнению с РВТ 109, если к ферментационной среде не добавляли неомицин.

Из упомянутых результатов следует, что предложен простой и эффективный способ продукции сериновой протеазы путем стабильного введения гомологичного или гетерологичного гена, кодирующего сериновую протеазу, в хромосому промышленных штаммов Bacillus. Кроме того, увеличенная продукция сериновой протеазы в хозяине Bacillus, который производит сериновую протеазу. Встраивание плазмидных конструкций в хромосому хозяйской клетки приводит к более стабильной ситуации в производственных ферментациях и значительно усиленной продукции протеазы, чем в присутствии конструкций с внехромосомальными плазмидами.

Различные методики работы с генами хорошо известны.

Клоны, содержащие встроенный фрагмент ДНК, кодирующий щелочную фосфатазу, могут быть обнаружены с помощью устойчивого маркера или путем использования способа прямой или положительной селекции, как разработанные для B. sublitis (Gryczan и Dubnow, Gene 20, 1982, 459-469). Кроме того, клоны, экспрессирующие высокощелочную протеазу, могут быть идентифицированы с помощью антител против продукта экспрессии, обнаружением потери субстрата или образования продукта протеолитического фермента. Например, колонии, экспрессирующие маркерный ген, такой как ген устойчивости к антибиотику, могут быть проанализированы на производство протеазы, определяемое по увеличенной преципитации ореола казеина вокруг колоний на чашках с агаром, содержащим казеин.

Формула изобретения

1. Способ получения сериновой протеазы, предусматривающий трансформацию штамма бацилл рекомбинатной плазмидной ДНК, культивирование трансформантов, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что трансформируют штамм щелочефильных Bacillus, при этом в качестве плазмидной ДНК используют PMAX4.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформацию штамма Bacillus осуществляют путем обработки штамма лизоцимом в щелочной среде при 20 - 37^oС, отделения образовавшихся протопластов от лизоцима, объединения протопластов с рекомбинатной плазмидной ДНК при той же температуре в присутствии реагента для смешения, регенерации клеток штаммов и выращивания регенерированных клеток в селективных условиях.

3. Штамм щелочефильных Bacillus PB 92/ pMAX-4 - продуцент сериновой протеазы.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6