Способ определения активности фосфодиэстеразы в биологическом материале
Использование: в физической химии и криобиологии, для определения активности фосфодиэстеразы (ФДЭ) в замороженном биологическом материале. Сущность изобретения: в биологический материал перед замораживанием вводят умбеллиферон в концентрации 10-6-10-7 М, ц= АМФ, и определяют интенсивность флуоресценции при длине возбуждения 350 нМ и максимуме волны флуоресценции 442 нМ. Интенсивность флуоресценции находится в обратной зависимости от количества расщепленного субстрата. Способ позволяет измерять активность ФДЭ в замороженном материале. 2 табл.
Изобретение относится к физической химии и криобиохимии и может найти применение при изучении механизмов замораживания - оттаивания, при консервировании сыворотки и клеток крови, тканей и органов.
Известен спектрофотометрический способ определения активности ферментов в переохлажденных растворах. Способ заключается в том, что реакцию проводят в переохлажденной среде, содержащей органические растворители (этиленгликоль, метанол, пропиленгликоль, ДМСО), точка замерзания которой ниже 0оС. Этот способ не позволяет определять фосфодиэстеразную активность непосредственно в замороженном биологическом материале. Известен способ определения активности эстеразы в замороженном биологическом материале, согласно которому в биологический материал вводят нефлуоресцирующее вещество - флуоресцеиндиацетат, замораживают и определяют интенсивность флуоресценции образующегося флуоресцеина, по которой судят об активности эстеразы. Однако этот способ вообще не позволяет определять активность дифосфоэстеразы. Наиболее близким к заявляемому является способ определения активности фосфодиэстеразы, основанный на расщеплении цАМФ змеиным ядом до биологически неактивного 5'-АМФ при инкубации в течение 10 мин при 37оС. Активность фермента определяют методом Фиске-Суббароу на спектрофотометре при 660 нм. Недостатком способа является то, что он не позволяет определять активность фосфодиэстеразы непосредственно в замороженном биологическом материале. Целью изобретения является определение активности фосфодиэстеразы в замороженном биологическом материале. Поставленная цель достигается тем, что в способе определения активности фосфодиэстеразы в биологическом материале, в него перед замораживанием вводят умбеллиферон при концентрации 10-6-10-7 М и по снижению флуоресценции умбеллиферона определяют активность фосфодиэстеразы. Способ осуществляют следующим образом. В биологический материал (суспензия клеток, гомогенат клеток тканей и органов) вводят субстрат реакции циклический аденозин-3', 5' монофосфат и умбеллиферон в концентрации 10-6-10-7 М. Пробы замораживают и определяют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350
1 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 1 нм. Интенсивность флуоресценции находится в обратной зависимости от количества расщепленного субстрата (см. табл.1). Из табл. 1 следует, что оптимальными концентрациями являются 10-6-10-7 М. При концентрации 10-5 М присутствует нерастворимый осадок умбеллиферона, а при концентрации 10-8 М чувствительность способа существенно снижается, что не позволяет достоверно судить о ходе реакции. Способ иллюстрируется следующим примером. Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Hitachi MPF2a (Япония) в кварцевых кюветах объемом 3 мл. В качестве среды инкубации использовали 3 мл солевой среды, содержащей 5 ммоль MgCl2 и 40 ммоль NaCl. В этот объем вносили 50 мкл биологического материала, 50 мкл цАМФ (конечная концентрация 1,9 мМ) и 20 мкл умбеллиферона (конечная концентрация 10-6 М) и сразу замораживали в парах жидкого азота до -10оС. После этого измеряли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 нм. Данная величина интенсивности флуоресценции служила в качестве контроля фосфодиэстеразной реакции. Через 24 ч хранения при -10оС определяли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 нм. Эту операцию повторяли дважды через 24 ч хранения при -10оС. В случае осуществления фосфодиэстеразной реакции при комнатной температуре (20оС) по такой же схеме, она полностью завершалась через 20 мин инкубации. Полученные данные приведены в табл.2.Формула изобретения
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ путем физико-химического анализа пробы, отличающийся тем, что, с целью определения активности фосфодиэстеразы в замороженном биологическом материале, в него перед замораживанием вводят умбеллиферон в конечной концентрации 10-6 - 10-7 М и по снижению интенсивности флуоресценции умбеллиферона определяют активность фосфодиэстеразы.
Похожие патенты:
Способ определения нефротического синдрома // 2014599
Изобретение относится к медицине, конкретно к способам диагностики, и может быть использовано при диагностике нефротического синдрома
Способ прогнозирования угрозы прерывания беременности у женщин с привычным невынашиванием // 2014598
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству
Изобретение относится к спортивной медицине, а именно к способам оценки специальной работоспособности спортсмена-саночника, и может быть использовано в процессе тренировки спортсменов
Изобретение относится к медицине, в частности к способам определения нарушения концентрационной способности почек
Способ определения гликемии в трупной крови // 2013773
Изобретение относится к медицине, а именно акушерству, и может быть использовано в женских консультациях и отделениях беременных
Способ определения численной плотности и объема элементов микроскопических структур в тканях // 2013765
Изобретение относится к области медицины, в частности к области морфологии, и может быть использовано для определения численной плотности и объема элементов микроскопических структур в тканях
Способ диагностики аутоиммунной патологии // 2012887
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в клинике для диагностики и дифференциальной диагностики аутоиммунной патологии
Способ индикации дистантного воздействия // 2012882
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для объективного и достоверного определения наличия дистантного воздействия биологического объекта на другой объект
Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии, патологической анатомии и судебно-медицинской экспертизе, и может быть использовано для количественной оценки выраженности отека ткани мозга, для экспертной оценки степени тяжести травмы спинного и головного мозга
Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии, топографической анатомии, патологической анатомии и может быть использовано для изучения лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах макромикроскопическом поле видения в норме, в возрастном аспекте, в эксперименте и патологии
Изобретение относится к медицине, в частности к способам неинвазивной диагностики функционирования биологических мембран и соответствующей оценке метаболических процессов в организме на клеточном уровне
Способ прогноза хронического рецидивирующего течения заболевания у лиц, перенесших первичную рожу // 2101701
Изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням и дерматологии, и может найти применение как в стационарных, так и поликлинических условиях
Способ определения реактивного лизиса клеток // 2101702
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости в клинической практике и в научных исследованиях
Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите путем биохимического исследования сыворотки крови
