Производное целлюлозы и госсипола, обладающее интерферониндуцирующим и противовирусным действием

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ я,с сн

М r N

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4907166/05 (22) 04.02.91 (46) 15.11.93 Бюл. Na 41-42 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.H.Ô.Ãàìàëåè РАМН;

Ташкентский научно-исследовательский институт химии и технологии хлопковой целлюлозы; Ташкентский государственный университет (72) Ершов Ф.И„Сайиткулов А.M.; Сарымсаков АА;

Мезенцева Nl.„Tàçóëàxoâà ЭБ.; Нажмутдинов Ш. (73) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (54) ПРОИЗВОДНОЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ГОССИ(в) RU (11) 2002755 Ñ1 (51) 5 С 08 В 15 00

ПОЛА, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИНТЕРФЕРОНИНДУЦИРУЮЩИМ И ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

{57) Использование: для лечения вирусных заболеваний человека, животных и насекомых. Сущность изобретения: производное целлюлозы формулы, . где а = 3 мас%, б = 63 мас%, в = 34 мас%, и = 530 — 532 Обладает интерферониндицирующей активностью и противовирусным действием. Получается окислением Na-карбоксиметилцеллюлозы с последующим взаимодействием с госсиполом при .

20-25 С2 — 4ч. 5 табл.

2002755

Изобретение относится к получению полимерных индукторов интерферона и может быть применено при вирусных заболеваниях человека, животных и насекомых, Известны синтетические карбоцепные полимеры, обладающие противовирусной и интерферониндуцирующей активностью: полиакриловэя кислота, сополимеры малеинового ангидрида с виниловым и виниловым эфиром; сополимеры малеинового ангидрида с метакрилоиланабазином. Эти препараты активно подавляют размножение вирусов, но они имеют ряд недостатков: плохая метаболизируемость в организме животных и обусловленная этим хроническая токсичность и сравнительно невысокий терапевтический индекс, Наиболее близким по достигаемому эффекту является низкомолекулярный полифенол — госсипол, который стимулирует синтез интерферона в организме экспериментальных животных и обладает противовирусной активностью, Недостатком госсиполэ является плохая растворимость в воде, высокая токсичность как для культуры клеток, так и для животных при сравнительно низкой интерферониндуцирующей и противовирусной активности, следствием чего является невысокий химиотерапевтический индекс этого вещества.

Целью изобретения является расширение арсенала новых веществ, обладающих водорастворимостью, низкОЙ токсичностью, высокОЙ интерферониндуцирующей активностью при интраперитонеальном, пероральном и ректальном пути введения, а также высокой противовирусной активностью против широкого спектра вирусных инфекций и с более высоким химиотерапевтическим индексом /ХТИ /.

Поставленная цель достигается структурой производного целлюлозы и госсипола общей формулы; где а = 3, б = 63, в = 34 (% мас.), и = 530-532, являющийся гетероцепным полимером с характеристической вязкостью()-0,06-0,1, обладающим противовирусной интерферониндуцирующей активностью. Это соединение, далее К-37, получают окислением— карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) одной кислотой и последующим взаимодействием с

0,0037 — 0,0075 моль госсипола при 20-25ОС. в течение 2-4 ч и осаждением продукта реакции в ацетоне.

Химическое строение препарата К-37 подтверждается И К, УФ и ЯМ Р-спектром.

Пример 1. В трехгорлую колбу с мешалкой помещают 24 г Na-КМЦ (степень . замещения 50, степень полимеризации 530) и прибавляют 776 мл воды с полным растворением Na-КМЦ, добавляют 426 г 12%-ного раствора иодной кислоты, перемешивание продолжают 2 ч при 20 С. Продукт осаждают ацетоном. промывают до полного удаления непрореагировавшей и образующейся в процессе окисления иодноватной кислоты. К очищенному продукту реакции прибавляют

456 мл воды и 1,96 г (0,0037 моль) госсипола и перемешивают втечение4ч при 20 С. Продукт реакции нейтрализуют до рН 7,8 0 1 н. раствором едкого натра, отфильтровывают и высаживают в ацетоне. Затем промывают ацетоном и сушат на воздухе, Полученный продукт представляет собой порошок светло-коричневого цвета. Выход 14,2 r. Характеристическая вязкость в воде(ту )=0,1.

Пример 2. Целевой продукт получают в условиях, описанных в примере 1, увеличивая количество госсипола до 3,88 г(0,0075 моль) и перемешивают в течение 2 ч при температуре 25 С Характеристическая вязкость () = 0,06, Выход 14, 85 г.

Дальнейшее увеличение содержания госсипола и времени реакции не приводит к увеличению содержания последнего в полимере.

При увеличении температуры реакции выше

25 С продукт реакции не высаживается в ацетоне. Снижение температуры реакции, уменьшение количества госсипола, взятого для получения К-37, ниже 1,96 r, а также времени реакции приводит к уменьшению концентрации госсипола в полимере, вследствие чего снижается биологическая активность полимерного препарата.

Результаты анализа элементного состава:

2ОЛ ь

На ИК-спектрах препарата имеются интенсивные полосы поглощения при 1610 см, характерные карбоксилат аниону карбоксиметильной группы, при 1460 см и 1385 см характерные бенэольному кольцу и метильной группе, соответственно, полифенола — госсипола, На УФ-спектрах препарата имеется интенсивная полоса поглощения при Х= 385 нм характерная нафталиновому циклу. По изменению интенсивности данной полосы рассчитаны содержание полцфенола в полимерной цепочке. Эмпирическая формула: (- (C4oH38014)a (C6H1oO5)6 - (CSH11O7 а)в), где а - Зф>, б - 63, в = 34 (мас.). и и =

=530-532.

Испытание. предлагаемого соединения (К-37) на цитотоксичность, интерферониндуцирующую и противовирусную активность ин витро и ин виво.

Цитотоксичность предлагаемого и репарата К.37 определяют в 24-48 ч культурах перевиваемой линии, клеток L 929. На монослой клеток, выращенных на дне 96-луночных панелей при 37 С в термостате с постоянным содержанием углекислоты

3,5 наносят различные концентрации изучаемого препарата. Через 24 ч контакта клеток с препаратом оценйвают цитотоксический эффект. Как показано в табл.1, увеличение концентрации препарата до 3000 мкгlмл не приводит к цитопатическомудействию препарата на клетки, в, то время как исходный госсипол обладает выраженной токсичностью для клеток уже при концентрации 125 мкгlмл.

Изучение токсического действия и редполагаемого соединения ин вива (на мишах).

Токсическую дозу К-37 определяют на белых беспородных мышах массой 10-12 r при однократном внутрибрюшинном введении различных концентраций препарата а обьеме 0,2 мл на мышь и вычисляют процент выживаемости животных через 2 недели после erо введения (табл.2). Как видно из табл.2, предлагаемый препарат К-37 при введении максимально растворимых количеств (2000 мг/кг) оказался нетоксичным, в

То время как исходный препарат госсипол обладает выраженной токсичностью уже при концентрации 100 мгlкг веса.

Сравнительное изучение интерферониндуцирующей активности госсипола и предлагаемого препарата К-37 ин витро. К монослоям клеток L-929 добавляют различные концентрации предлагаемого препарата К-37 и госсипола в сочетании с

ДЭАЭ-лекстраном. После 4- часового контакта с препаратами клетки двухкратно отмывают раствором Хэнкса и добавляют 199 среду с 2 бычьей сыворотки. Титры интерферона в культуральной жидкости определяют через 24 ч по подавлению цитопатического действия (ЦПД) тест-вируса энцефаломиокардита мышей (EMC) микрометодом на гомологичных культурах. К-37 обладает выраженной интерферониндуцирующей активностью при использовании

его в концентрации 250 мкг/мл (табл.3). Тит10 ры интерферона (ИФН), синтезируемого в ответ на введение К-37 в культуру клеток

199, в 12 — 13 раэ превышают уровень ИФН, образовавшегося в ответ на введение исходного препарата госсипол. предлагаемого соединения ин виво (на мышах).

Интерферониндуцирующую активность предлагаемого соединения -37 и исходного госсипола на мышах определяют при пероральном, ректальном и подкожном пути введения. Результаты проведенныхиспытаний приведены в табл.4. При пероральном пути введения К-37 максимальная продукция сывороточного интерферона достигает

25

640 ед/мл и отмечается при дозе 25 мг/кг.

При ректальном введении К-37 в дозе 10 мг/кг веса титры интерферона достигают в сыворотке крови 1280 — 2560 ед/мл, при подкожном введении в той же дозе — 1280 ед/мл.

Титры ИФН, синтезированного в ответ на введение К-37, в 16 — 32 раза превышают уровень ИФХ, индуцированного госсиполом, Противовирусная активность К-37 ин виво (на мышах), 35 Защитное действие К-37 изучают при инфекциях, вызванных вирусами энцефаломиокардита мышей (штамм" Колумбия" ) гриппа (штамм R-94 ) гепатита мышей (штамм "Мищерина") на белых беспородных мышах массой 12 — 14 г. Препараты вводят в эффективной дозе в объеме 0,2 мл через 4 ч после заражения вышеуказанными вируса40 ми. Доза заражения вируса энцефаломиокардита мышей составляет 5,0 — 6,0 tg

ЛДцо/0,2 мл и гепатита мышей 6,0 Ig

ЛДы/0,2 мл. Гемагглютинирующий титр вируса гриппа составляет 1;1024 ед/мл, Результаты суммированы в табл,5.

Полученные данные дают основание счи45

50 тать, что предлагаемый препарат при применении по лечебной схеме обладает выраженной противовирусной активностью в отношении широкого спектра экспериментальных вирусных инфекций. (56) Садыков А.С. и др, Индукторы интерфе55 рона, Ташкент. 1978, с. 304.

Авторское свидетельство СССР

%886989, кл, В 02 С 21/00, 1980.

Авторское свидетельство СССР

М 721103, кл. А 61 К 45/02, 1979.

15 Интерферониндуцирующая активность

Таблица1 цитотоксическое действие госсипола и К-37 ин витро (на культуре клеток L-929)

Примечание. /+/ = 25, /++/ = 50%, /+++/= 75%,/++++/ 100% гибели клеток; /-/— отсутствие токсического действия.

Таблица2

Изучение токсичности предлагаемого препарата К-37 ин виво (на мышах)

Примечание. На каждую дозу препаратов брали по 20 мышей. " Данные литературы.

ТаблицаЗ

Сравнительное изучение интерферониндуцирующей активности госсипола и К-37 ин витро (на культуре клеток 1 -929) 2002755

Продолжение табл.3

Таблица4

Таблица5

Противовирусная активность предлагаемого препарата К-37 ин виво (на мышах) Интерферониндуцирующая активность предлагаемого препарата К-37 и госсипола ин виво (в сыворотке крови экспериментальных животных) 2002755

12 тени я и госсипола

ll N

СВ ОСН ССПМ

lI г Ф. ас о

Э э

Редактор Т.Салирханов

Тираж По,.записное

НПО "Поиск".Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3214

Производственно-издательский комбинат "Патент",r, Ужгород, ул. Гагарина. 101

Формула иаобре

Производное целлюлозы формулы где а = 3 мас, 7; б = 63 мас„ 3 в = 34 мас. 6: и =530-532, 5 обладающее интерферониндуцирующим и противовирусным действием.

Составитель О.Рокачевская

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор П,Гереши