Способ получения h-y-антисыворотки для определения пола при пересадке эмбрионов

 

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Я :""."",."",„",.„„

К ПАТЕНТУ 1

ЬЭ

CO

С0

Ch

ЬЭ

1 (21) 5031580/13 (22) 100392 (ж) 30.10.93 Ь ЬЬ 39-Ео (71) Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства (72) Букаров Н.Г. (73) Всероссийский научно-исследовательский ектитут животноводства (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ <Н-т>-АНТИСЫВОРОТКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА ПРИ

ПЕРЕСАДКЕ ЭМБРИОНОВ (57) Использование: в биотехнологии при попучеон Ю1 (и> 2 01627 С1 (51) А61К 9 9 01N33 7 нии антисывороток применяемых для определения пола у млекопитакхцих при пересадке эмбрионов

Сущность применения: иммунизируют самок путем введения в их селезенку частиц кожи сингенного самца Через 15 — 20 дней у самок отбирают кровь дпя приготовления из нее Н вЂ” У вЂ” антисыворотки

Спустя 7 — 25 дней однократно или через тот же срок повторно проводят поддерживающую иммунизацию инъекциями 35-40х10 клеток селезена в сингенного самца внутрибрюшинно. 2 табл

2001627

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении антисывороток, применяемых для определения пола у млекопитающих при пересадке эмбрионов, Известен способ получения Н-У-моноклонального антитела — гиклоналана, имеющего селективмое связывающее родство к антигену Н-У. Иммунологический способ для идентификации и отделения мужских клеток от женских половых клеток включает контакт смешанных мужских и женских клеток с моноклональным внтителом - гиклона ланом; селективную иммумологическую реакцию между мужскими клетками и гиклоналаном, имеющую результатом комплекс антител мужских клеток; обнаружение данного комплекса и отделение женских клеток от данного комплекса (1).

Главная особенность моноклонвльных антител, получаемых известным способом, — идеальная однородность (гомогенмость), Свойства таких препаратов антител длительное время остаются постоянными. Однако значительным недостатком известного способа является высокая стоимость монокломов из-зэ трудоемкости их получения.

Кроме того, в ряде случаев моноклональные антитела, кэк и поликлонэльные, могут проявить низкую аффимность. В результате часть антигенов может остаться невыявленной, В таких случаях необходимо проведение оценки и отбора реагентов (сывороток) лучшего качества.

Наиболвв близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения Н-У-антисывороток путем многократных внутрибрюшинных иммунизаций высокоинбредных мышей линии С 57 Bl/6 (2). При этом реакция взаимодействия антигена с антителом выявляется после связывания с ФИТЦ-коньюгатом (флуоресцеиноэотиоцианат) комплекса антиген-антитело. В случэеположительной реакции, т.е. свяэывамия Н-У-антител с антигеном, в флуоресцентном микроскопе выявляют желто-зеленое свечение (флуоресценция). Такие флуоресцирующие эмбрионы развиваются у самцов, а месветящиеся — у самок. Посредством применения Н-У-антисыворотки обнаруживают

Н-У-антиген на бластомерах эмбрионов практически у всех видов млекопитающих животных. Известный препарат Н-У-антител может быть использован для идентификации пола любых клеток.

Основные недостатки этого метода— трудоемкость процедуры ч ее продолжительность. Она включает 2-3-разовые иммунизации в неделю на протяжении 3-4

50 недель с последующими добавочными иммунизациями через каждые две недели. При. этом нужно готовить антиген путем многократного промывания клеток селезенки самцов в заданной дозе: 35 — 40 10 клеток в 0,1 мл.

Цель изобретения — повышение эффективности способа.

Это достигается тем, что в известном способе, включающем введение антигена, отбор сыворотки, постановку тестов на обнаружение H-У-антигена, особенностью является то, что выработку Н-У-антител проводят внутриселезвмочной иммунизацией самки частйцэми кожи сингенного самца с последующими одно- или двукратными добавочными внутрибрюшными реиммунизациями 35-40 10 клеток селезенки син6 генного самца.

В процессе исследований было установлено, что оптимальным является сочетание вмутрисвлезвмочной иммунизации инбредных мышей линии С 57 Bl/6 с добавочными реиммунизациями (1-2 раза) через 7-25 дней. По своим качествам полученная таким образом энтисывороткэ при аттестации эмбрионов не уступает той, что была получена известным способом. т.е. многократными внутрибрюшными инъекциями 35-40 10 клеток селезенки сингенмого самца.

Принципиальное отличие предлагаемого способа получения Н-У-антител методом внутрисвлвзеночной иммунизации (трансплантации) кусочками кожи самца самок от обычных внутритканевых иммунизаций, в нутримышечной, внутрикожной и др. типов иммунизаций заключается в механизме протекающих при атом процессов, Так, на начальном этапе иммунизации имеет место активный синтез Н-У-антигена. возникающий вследствие пролиферации клеток прижившегося трансплантата.

Непосредственный контакт вновь синтезируемых Н-У-антигенов с иммунокомпетентными клетками селезенки обеспечивают высокий уровень иммунного ответа на указанный слабый антиген. Обычно после 1012 дней пересадки трансплантата наблюдаются острая реакция отторжения организмом самки мужского трансплантата — источника Н-У-антигенов, его последующее разрушение и изоляция. Этот процесс сопровождается формированием высокого уровня Н-У-антител в сыворотке крови, Этого результата трудно достигнуть другими методами из-за низкой плотности распределения Н-У-антигена на тканях и крайне низкой иммумогенности этого антигена.

2001627

Поэтому сыворотки (антисыворотки), полученные другими методами, обычно характеризуются низкими титрами, несмотря на продолжительность иммунизаций. Таким образом, при обычных способах иммунизации имеют место дефицит и недостаточная концентрация антигена в иньецируемой смеси (если используются еще и адъюванты).

Попытки удаления из Н-У-сывороток контаминированных аутоантител часто приводят к инактивации сывороток и невозможности их использования для определения пола эмбрионов.

Вышеперечисленные трудности в значительной мере устраняются при использовании метода внутриселезеночной иммунизации в первую очередь эа счет получения Н-У-сывороток с высокими титрами и такого качества, которые бы были способны обнаруживать антигены на бластомерах ранних эмбрионов.

Полиморфизм Н-У-антигена представлен 3 типами: серологически выявляемый и соответственно обозначаемый как Н-У,, идентифицируемый цитотоксичес кими Тклетками -Н-У и идентифицируемый методом трансплантации -Н-У1.

Взаимоотношения между указанными типами антигенов не изучены.

Исследования показали, что в полученных сыворотках содержатся антитела к антигену Н-У, т,к. с помощью полученных сывороток удается дифференцировать Н-У и Н-У эмбрионы серологическим методом.

Следовательно, повышение эффективности способа с помощью заявляемого изобретения заключается в том, что в результате внутриселеэеночной иммунизации самки кусочками кожи сингенного самца получена активная сыворотка, содержащая Н-У-а нтитела, направленные к Н-У-антигену ранних эмбрионов, т,е. способная выявлять наличие антигена самцов на бластомерах ранних эмбрионов.

Пример. Внутриселезеночную иммунизацию проводили в опыте на 5 самках С

57 8l/6. Под ветбуталовым наркозом, разрезом с левой стороны, на боку достают селезенку, в которую с помощью иглы вводят по

3-4 кусочка кожи хвоста самца диаметром около 1 мм и зашивают разрез. Спустя 1520 дней у них отбирают кровь для получения

Н-У-антисыворотки, в дальнейшем поддерживающие иньекции антигена (реиммунизация) делают с интервалом 7-25 дней.

Реиммунизация, как с меньшим. так и с большим интервалом, по сравнению с отмеченным дает меньший титр Н-У-антисыворотки. Доза антигена — суспензии клеток

15 селезенки сингенного самца составляла 3540 10 клеток. Иньекции антигена проводили внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл суспензии клеток на физрастворе. Кровь для получения сывороток отбирали иэ хвоста жи в отн ы х.

Контрольная группа животных — 6 самок

С 57 В1/6 из той же партии, что и опытная, была иммунизирована 11 раз внутрибрюшинно (табл. 1). Подобная схема является традиционно используемой в серологии НУ-антител.

Эмбрионы 3,5-дневного возраста от мышей линии ICR были аттестованы с использованием эитисыворотки, полученной внутриселезеночиой иммунизацией с последующими двумя реиммуниэациями (реагент N. 1) и антмсыворотки, полученной после внутрибрюшинных иммунизаций (ре20 агент (Ф 3).

Аттестацию эмбрионов на Н-У и Н-У осуществляли нэ микроскопе МБИ-15У с помощью непрямого иммунофлуоресцентного метода, где в качестве первых антител ис25 пользовали полученные антисыворотки.

Продолжительность инкубации в Н-У-антителах составляла 40-45 мин, затем отмытые эмбрионы помещали в 10 -ный ФИТЦконъюгат иммуноглобулинов на 20 — 30 мин.

30 Поглощение ФИТЦ при длине волны 495 ммк, опускание желто-зеленого цвета при длине 510 мкм.

Эмбрионы, иммуногенетически определенные как одного пола (H-У вЂ” предполага35 емые самцы, Н-У вЂ” самки), пересаживали по

3-8 шт. в правый рог матки реципиентов, левый рог служил контролем.

Определение морфологического пола развившихся эмбрионов осуществляли на

40 14 день беременности самки. К этому сро:<у гонады плодов имеют значительные морфологические различия, и они были идентифицированы по морфологическому полу со

1007-ной точностью. Одновременно реги45 стрировали и число резорбций (табло. 2).

Из данных, приведенных в табл. 2, видно, что при примерно одинаковом уровне приживляемости эмбрионов (26,7-23,3 g,), при использовании антисывороток М 1, N. 3

50 и в контроле существенные различия выявляются в уровне резорбции пересаженных эмбрионов. Общее число резорбций в контроле выше. Это свидетельствует о том, что при определении пола эмбрионы, потенци55 ально не способные к развитию, элиминируются. Это свойство в большей степени характерно для антисыворотки, полученной методом внутриселезеночной иммунизации.

2001627

Таблица 1

Схема иммунизаций инбредных мышей-самок С 57 BI/6 для получения Н-У-антисывороток, используемых для определения пола эмбрионов

Отбор крови на антисыворотку

Число животных

Титр антисыворотки

Соотношение Н-Y

Н-Y эмбрионов

Способ иммунизации и дата ее проведения

2,03,89

1:16

22.03.89 (реагент М 1)

17.04,89 (реагент М 1) 25:31

1:8

174:214

29.05.89 реагент N. 3

1:16

133:123

Таким образом, использование Н-У-антисыворотки, полученной при внутриселеэеночной иммунизации с последующей реиммунизацией клетками селезенки (3540 10 клеток) сингенного самца, гарантирует определение пола у эмбрионов с точностью 77-80 7ь, снижает число реэорбций пересаженных эмбрионов.

При использовании контрольной антисыворотки (ЬЬ 3), полученной известным методом — внутрибрюшин ными иммунизациями, были получены схожие результатыы — 75-80 $-ная точность определения пола 3,5-дн es н ых эмбрионов-бластоцист. Однако ее получение потребовало больше времени. сама схема является относительно трудоемкой.

1. Внутриселезеночный — 2.03,89

Реиммунизация внутрибрюшинная клетками селезенки — 22,03.89 в дозе 35-40 10 (0,1 мм)

Реиммунизация внутрибрюшинная клетками селезенки — 10.04.89 в дозе 35-40 10 (0,1 мл)

2, Все иммунизации внутрибрюшинные, доза антигена 35 — 40 10 (0,1 мл) клетками селезенки

27.02.89 5.05.89

2.03.89 11.05.89

6.03.89 16.05.89

9.63.89 19,05.89

13.03.89 22,05.89

10.04.89

Затраты времени и труда в этом случае более чем в 2,5-3 раза превышают аналогич-ные показатели предлагаемой схемы получения Н-У-антисывороток.

5 Способ применим в практике определения пола пересаживаемых эмбрионов всех аидов млекопитающих, прежде всего эмбрионов крупного рогатого скота и овец. На основе применения предлагаемого способа

10 могут быть созданы банки замороженных эмбрионов с идентифицированным полом. (56) 1. Патент США М 4511661, кл. G 01 N 33/54, 33/58. С 12 N 15/00, 1983.

2. J, R. Pledrahlta, G. В. Anderson. J, Reprod. Fenll., 74, 1985, с, 637-644.

2001627

Таблица 2

Влияние способа получения Н-Y-антисывороток, используемых для определения пола эмбрионов, на точность определения и уровень резорбций эмбрионов после пересадки

Резорбций на 14

Самки:самцы

Точность оценки, Число эмбрионов на 14

H- Y-анти- Число саАттестация эмбмок реципиентов, в т.ч. бесыворотка, Q день развития n, $ рионов день развития п, еменных

2 (2,1) 11 (10.8) 20/6

28/7

97/9 26 (26,3)

102/57 35 (34,3) 16/9

15/9

76,9

80,0

2 (2,4) 20 (20,6) 4/16

5/15

20 (24,39)

20 (20.62) 16/8

19/8

82/42

97/41

80,0

75,0

35 (9,3) 57/44*

66/34

378/189 101 (26,7) 78,2 всем атгестованным эмбрионам

Контрольная

30/38

46 (15,8) 292/127 68 (23,3) 48/20 г ппа

*-3 реципиента, которым были пересажены мужские эмбрионы. выбыли из опыта после хирургической пересадки, Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Н-Y-АНТИСЫВОРОТКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА 5

ПРИ ПЕРЕСАДКЕ ЭМБРИОНОВ, включающий введение антигена, отбор сыворотки, постановку тестов на обнаружение Н-Y-аитигена, отличающийся тем. что в качестве

10.

Составитель И. Агафонова

Техред М.Моргентал Корректор М. Самборская

Редактор Л. Павлова

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3140

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Н-Y (определены как самки)

Н-Y (оп ределены как самцы)

Итого по

Перенесено эмбрионов беременных антигена используют частицы кожи сингенного самца, введение осуществляют однофаэово внутриселезеночным способом, а затем дополнительно проводят одно- или двукратно внутрибрюшинную реиммунизацию клетками селезенки сингенного самца