Способ получения биоавтограмм

(19) RU (11) (51) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ 9Г ИВЮМ ..". " - 1E_#_МЯ ""»; . ИОТЕн/

ЬЭ

СР

CO

С0

От

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4311937/13 (22) 01.10.87 (46) 15.10.93 Бюл. Ня 37 — 38 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологических методов защиты растений (72) Николаева С.И. Завелишко ИА.; Харбур М.B. (73) Институт биологической защиты растений АН

Республики Молдова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОАВТОГРАММ (57) Использование микробиология, медицина.

Сущность изобретения: хроматографическую пласЭ I. ! тину (бумагу) после разделения на ней исследуемого раствора, содержащего антибиотик, покрывают слоем стерильной питательной среды, а затем вносят инокулюм тест — объекта в виде полосок растущего на твердой питательной среде газона, располагая их вдоль боковых сторон хроматографической пластины. Изобретение позволяет использовать в качестве тест-объектов любые мицелиальные грибы, в том числе не применявшиеся ранее из-за сложности равномерного внесения инокулюма. 1 зл.ф-лы, 2 ип, 1 табл.

2001105

Изобретение относится к определению биологически активных веществ в микробиологии, медицине, химии, а именно к биоавтографическому обнаружению антибиотиков в различных растворах.

Известен способ обнаружения антибиотиков биоавтографическим методом, при котором исследуемый раствор наносят на хроматографическую пластину (бумагу), элюируют и высушивают. На подготовленную таким образом пластину(бумагу) наносят слой питательной среды, предварительно инокулированной спорами тест-культуры. Затем пластину помещают в условия, благоприятные для роста тесткультуры. В течение определенного времени (от нескольких часов до нескольких суток в зависимости от температуры и особенностей роста микроорганизма) споры прорастают по всей поверхности пластины. В тех местах, где располагаются антибиотики, культура тест-обьекта не растет или рост ее заметно угнетен. На хроматограммах таким образом проявляются "пятна" антибиотиков.

Однако такой способ непригоден для использования в качестве тест-объектов ряда широко распространенных в природе мицелиальных грибов, таких как Sclегоtinia, Rhizoctonia и др. У этих патогенов получение спор требует особых трудоемких, долговременных и плохо воспроизводимых приемов.

Например, сумкоспоры Sclегоtlnia

sclегоtiorum можно получить после длительного (1 — 2 мес) промораживания склероциев с последующим помещением их во влажный субстрат, при этом в течение 30-38 сут возможно образование апотециев с сумками и сумкоспорами. Этот метод получения спор неприемлем для использования в биавтографии иэ-за длительности и плохой воспроизводимости, Такие микроорганизмы не использовались в качестве тест-объектов.

Эти широко распространенные в природе патогены наносят огромный ущерб сельскохозяйственным и декоративным растениям.

В настоящее время ведется широкий поиск биологических методов борьбы с этими патогенами. Поэтому воэможность их использования в биоавтографии позволит значительно расширить спектр тест-объектов, эффективно и целенаправленно проводить поиск антибиотиков и их продуцентов.

Целью изобретения является расширение круга применяемых в биоавтографии тест-объектов путем возможности использования любых мицелиальных грибов, растущих на твердых питательных средах.

Способ поясняется фиг. 1 и 2, Цель достигается тем, что на подготовленную хроматографическую пластину 1 (бумагу) сначала наносят слой твердой питательной среды 2 толщиной 2 — 3 мм, затем сверху вдоль ее боковых сторон накладывают полоски твердой питательной среды с растущим на ней газоном культуры тест-объекта 3 шириной 3 — 4 мм, толщиной

2 — 3 мм и длиной, равной длине пластины (фиг. 1). Пластину помещают в благоприятные для роста культуры условия, Тест-объект начинает распространяться по пластине быстро и равномерно с двух сторон, постепенно заполняя всю поверхность. При наличии антибиотиков образуются "пятна"— зоны подавления роста тест-объекта (фиг. 2).

Заявляемый способ отличается от известного тем, что инокулюм тест-объекта вносится на покрытую стерильной питательной

20 средой пластину в виде растущего мицелия, Таким образом, сложная и длительная процедура получения спор для мицелиальных грибов становится ненужной. Благодаря тому что, в заявляемом способе инокулюм микроорганизма размещается полосками вдоль боковых сторон пластины, тест-объект распространяется по ее поверхности равномерно.

На пластину "силуфол" размером 35 х

110 мм наносят экстракт гриба Trichoderma

harzianum, обладающий антибиотической активностью. Пластину элюируют в системе гексан-этилацетат-этанол 10;1:3. После высушивания ее покрывают слоем агариэованной питательной среды толщиной 2 — 3 мм.

Вдоль боковых сторон сверху накладывают полоски такой же питательной среды с растущим на ней газоном Sclегоtinia

sclегоtiorum, Толщина полосок 2-3 мм, ши40 рина 3-4 мм, длина 110 мм. Подготовленную таким образом пластину в стерильном сосуде помещают в термостат (t = 23 +. 1 С), В течение 2 сут Sclегоtinla sclегоtiorum равномерно покрывает всю поверхность пласти45 ны за исключением эон расположения антибиотиков, имеющих Rt 0,07 и 0,70

Использование предлагаемого способа получения биоавтограмм обеспечивает по сравнению с существующим способом следующие преимущества, использование в качестве тест-объектов любых мицелиальных грибов, растущих на твердых питательных средах, в том числе не применявшихся ранее; сокращение числа операций, а следовательно, и времени на получение биоавтограмм за счет исключения стадии получения спорового материала (см. таблицу) (56) Егоров H.Ñ. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986, 448 с, 2001105

Блинов Н.О. и Хохлов А.С. Бумажная хроматография антибиотиков. М.: Наука, 1970, 364 с.

Сравнительная оценка способов получения биоавтограмм по прототипу и предлагаемому способу на примере тест-обьекта S.sclегоtiorum.

П е лагаемый способ

П ототип....3-4 сут

Получение мицелия........3 - 4 сут не надо не надо

Получение мицелия„...3-4 сут

Образование склероциев..„....30 сут

Промораживание склероциев..., средой и наложение сверху полосок расту1 щего мицелия ............................,.0,5 сут

Проявление биовтограммы .......2 сут

Проявление биоавтограммы „....,2 сут

4опе ации,7с т

Итого: 7 опе аций, 70 с т

Помещение склероциев во влажный субстрат и проращивание до обрахования апотециев с сумкоспорами .......30 - 38сут

Подготовка хроматографической пластины: нанесение экстракта, элюирование, высушивание ..„,...0,5 сут

Внесение сумкоспор в питательную среду и покрытие ею пластины 0,5 сут

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОАВТОГРАММ, вклЮчающий покрытие хроматографической пластины после разделения на ней исследуемого раствора, содержащего антибиотик, слоем питательной среды с тест-обьектом, отличающийся тем, что, с целью расширения круга применяемых тест-обьектов, хроматографическую пластину сначала покрывают слоем стерильной питательной среды, а затем сверху, не надо

Подготовка хроматографической пластины: нанесение экстракта, элюирование, высушивание...0,5 сут

Покрытие пластины стерильной питательной

5 вдоль боковых сторон накладывают поло ски твердой питательной среды с растущим на ней газоном тест-обьекта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, 10 что полоски твердой питательной среды с растущим на ней газоном тест-объекта имеют ширину 3 - 4 мм, толщину 2 — 3 мм и длину, равную длине хромагографической

15 пластины.

° ° ° ° °

° °

° 4

Ф . ° °

° °

° °

1 °

° °

° ° ° °

° °

° I

° ° . ° °