Способ получения вируса миелобластоза птиц

 

Область использования, микробиология Сущность изобретения получение вируса миелобластоза птиц в высоких титрах включает внутривенное заражение безлейкозных, инбредных 7 - 8-дневных цыплят дозой 02 мл при разведении нативной - 15 -2 512 плазмы до 10 -10 с титром 5x10 частиц/мл, полученной от индивидуальных цыплят, или смесью плазмы от нескольких 3 - 4-дневных цыплят 31 пассажа породы Русская белая разводки НИЛбиомоделей АМН СССР, селекционированных с применением дозы вируса 02 мл в разве з дении нативной плазмы до 10 на высокую чувствительность к заражению ВМП в объеме 10 - 36% от общего их количества, с заражением в цевочную вену лапки цыпленка и обескровливанием методом внутрисердечной пункции на 11 - 13 сутки после заражения 1 ил, 3 табл

г" lk !

Едет И"ЕК,6, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам н товарным знакам (21) 5018391/13 (22) 14.01.92 (46) 15.10.93 Бюл. Nt 37-38 (71) Научно-исследовательская лаборатория экспериментально-биологических моделей AMH СССР (72) Ратькин Э.В„Пикер ЕГ. Зпотина ЕВ. (73) Научно-исследовательская лаборатория экс— периментально-биологических моделей AMH СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСА МИЕЛОБЛАСТОЗА ПТИЦ (57) Область использования: микробиология. Сущность изобретения: получение вируса миелобластоза птиц в высоких титрах включает внутривенное заражение безлейкозных, инбредных 7 — 8-днев(в) RU (и) 20ОИО2 С1 (51) 5 C12N7 00 ных цыплят дозой 0,2 мл при разведении нативной — 1.5 -г.5 тг плазмы до 10 — 10 с титром 5х10 частиц/мп, полученной от индивидуальных цымят, или смесью плазмы от нескольких 3 — 4 — дневных цыплят 31 пассажа породы "Русская белая раз— водки НИЛбиомоделей АМН СССР, селекционированных с применением дозы вируса 0,2 мл в разве-з дении нативной плазмы до 10 на высокую чувствительность к заражению ВМП в объеме 10 — 3696 от общего их количества, с заражением в цевочную вену папки цыпленка и обескровпиванием методом внутрисердечной пункции на 11 — 13 сутки после заражения. 1 ил, 3 табл.

2001102

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения микроорганизмов, в частности вирусов миелобластоэа птиц в высоких титрах.

Известен способ получения вируса миелобластоза птиц в высоких титрах в организме инбредных цыплят, свободных от патогенной микрофлоры. (Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований, тезисы всесоюзной конференции 1987 г, М., 1988, ч. 1, с. 38 — 41), Указанная технология отрабатывалась на 3 — 4-дневных цыплятах и позволяла получать титры вируса миелобластоэа птиц (ВМП) в среднем 3-5 х 1012 вирусных частиц в 1 мл плазмы крови при 100 заражаемости цыплят. Объем плазмы в расчете на одного обескровленного цыпленка составил

3,2 мл.

Однако при заражении цыплят более старшего возраста не исключалось дальнейшее повышение титров вируса и объемов плазмы от одного обескровленного цыпленка, т.е. существовала возможность качественного и количественного совершенствования технологии (лабораторные животные для медико-биологических и биотехнических исследований, тезисы конференции 1990 г, М., 1990 г, с. 119), Для экспериментов согласно прототипу были выбраны 7 — 8-дневные цыплята. В серии пассажей на таких цыплятах показано, что титр вируса составляет в среднем 5 — 6 х

10 частиц в 1 мл и выделены отдельные образц1i плазмы с титрами от 3,2 х 10 до

12

1,2 х 10 частиц/мл. Заражаемость цыплят колебалась в пределах 95 — 100ь, .объем плазмы от одного цыпленка увеличился в среднем до 4,5 мл, К недостаткам указанной технологии следует отнести нестабильность высоких титров вируса и выхода увеличенных объемов плазмы, прогнозный характер результатов.

Цель изобретения — повышение стабильности титров вируса и выхода увеличенных объемов плазмы.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения вируса миелобластоза птиц в высоких титрах, включающем внутривенное заражение беэлейкозных, инбредных 7-8-дневных цыплят дозой 0,2 мл при разведении нативной плазмы 102, полученной от индивидуальных цыплят, или смесью плазмы от нескольких 3 — 4-дневных цыплят с максимальными титрами вируса после 17го пассажа с заражением в цевочную вену лапки и обескровливанием методом внутрисердечной пункции на 11-13-е сутки после

45 заражения, заражение цыплят 7 — 8-дневного воз 1аста производят 0,2 мл разведенной до 10 — 10 плазмы с исходным титром 5

- .5 -2, х 10 частиц/мл, полученной от 31 пассажа

12 вируса на 3 — 4-дневных цыплятах, при этом в качестве доноров используют цыплят породы "Русская белая" разводки НИЛбиомоделей AMH СССР, селекционированных с применением дозы вируса 0,2 мл в разведении нативной плазмы до 10 к заражению -з

ВМП в объеме 11 — 36 от общего их количества.

Отличительными особенностями способа получения вируса миелобластоэа птиц в высоких титрах является заражение цыплят

7 — 8-дневного возраста 0,2 мл разведенной

-1,5 -2,5 до 10 — 10 плазмы с исходным титром 5 х 10 частиц /мл, полученной от 31 масса12 жа, и использование в качестве доноров безлейкозных цыплят породы "Русская бе-. лая" разводки НИЛбиомоделей АМН СССР, селекционированных с применением дозы вируса 0,2 мл с разведением нативной плазмы до 10 на высокую чувствительность к -з заражению ВМП в объеме 11 — 367; от общего их количества.

В качестве объекта исследования использовались цыплята породы "Русская белая" разводки НИЛбиомоделей, селекционированные на высокую чувствительность к заражению ВМП, позволяющие получать максимально возможные титры в плазме крови цыплят и сохранять его биологическую чистоту.

Инфицирующим материалом служил вирус миелобластоза птиц штамма BAI-А, полученный из Института вирусологии AMH

СССР (первичный источник — лаборатория

Д.Бирда, США). Для заражения вирус вводили в цевочную вену лапки цыпленка, обескровли вали цыплят методом внутрисердечной пункции на 11-13-е сутки, когда уровень миелобластозов в периферической крови достигал 50-60 g no отношению ко всем клеткам крови. Собранную кровь центрифугировали 15 — 20 мин при

3000 об/мин при 4 С. У павших и обескровленных цыплят при патологоанатомическом вскрытии подтверждался диагноз на миелобластоз. Вирус вводили 3 — 4-суточным цыплятам в дозе 0,2 мл при разведении нативной плазмы 10 . Хранение и транспор-2 тировку плазмы осуществляли в жидком азоте, в специальных флаконах, Исследования проводились с соблюдением требований стерильности, Основной критерий эффекта заражения — процент заболеваемости миелобластозом цыплят.

Гематологическим критерием динамики инфекционного процесса было число мие2001102 (56) Лабораторные животные для медикобиологических исследований, тезисы конференции, 1980Ä fv1., с. 119.

Таблица 1

Динам;.кз злр жэемости цыплят Ll титра ВМП при пассировании вируса на 3 — 4I-дневных безлейкозных цыплятах породы "Русская белая" лаб I,Lñlîýных клеток, определяемых в мазках кро.ъ . Для количественной оценки содержэн 1я ВГЛП в плазме испольэовали спек1рофотометрический метод определения т..тра вируса по АТФ-ной реакции. 5

На 3 — 4-дневных цыплятах получали титр вируса в среднем.1 х 10 частиц в 1 мл

12 при 100 j,-ной заражаемости цыплят, Объем плазмы LL расчете на цыпленка составил 3,2 мл, эти показатели не менялись с 17 по 31-й 10 пассажи ВМП (табл. 1. чертеж).

Затем на 7-8-дневных цыплятах получали плазму с титрами вируса 5-6 х 10 час12

-,LIö в мл при заражаемости цыплят 95-100;(, с увеличениеM обьема плазмы от одного 15 цыпленка до 4,5 L.1л (фиг. 1).

Для стабилизации выхода плазмы с высокими титрами вируса и ее увеличенными обьемами наряду с адаптацией вируса методом последовательного заражения плазмой 20 с наивысшими титрами разных пассажей проводилось селекционирование, направленное на выведение высокочувствительной к ВМП линии кур разводки НИЛ ЭБМ

АМН СССР, первоначально на 3 — 4-дневных, 25 а затем нэ 7 — 8-дневных цыплятах. Оценка особей, входящих в группу производителей следующей генерации, проводилась по потомству, т,е. по чувствительности цыплят каждой курицы к ВМП. Степень чувстви- 30 тельности цыплят определялась по количеству дней, прошедших со дня заражения до момента гибели животных от миелобластоза при дозе Д;о, которая составила 0,2 мл

I! pLI разведении нэтивнсй плазмoI 10 . 35

-з

Ципл«гэ, пэвн.ие на 14 — 15-е сутки, считались высокочуocãlçLITñJIüíûl è, нэ 16 — 17-е сутки — чувствительными и нэ 18 — 21-е сутки — низкочувствигельными. Цыплята, у кото1-,ых к 21-мудню после заражения не нэбл1о- 40 дэIIось накопления миелоблэст03IIblx клеток, оценивались как устойчивьмп r, ВМП.

Способ поясняется чертежом.

По степени чувствительности цыплята распределялись следующим образом, ь; высокочувствительные {14-15 день) 11-36 чувствительные (16-17 день) 15 — 27 низкочувствительные (18 — 21 день) 23-29

Эти данные использовались для составления схем скрещивания при формировании новой генерации птицы. При этом учитывали два показателя: общий процент заражаемости цыплят каждой курицы и число цыплят. заболевших в ранние сроки (1115-й день) после заражения.

Ip«применении на таких цыплятах доэ вируса 0,2 мл при разведении 10 -10 у

7 — 8-дневных цыплят удалось достичь 95—

100 заражаемости и возможности обескровливания основной массы цыплят на

11-13-сутки (табл. 2). Последнее позволяет получить от этой группы стабильные обьемы плазмы с высокими титрами (табл. 3), Установлено, что наиболее экономически целесообразно испольэовать для достижения поставленных целей цыплят с высокой чувствительностью к BMfl.

Использование способа получения вируса миелобластоза птиц в высоких титрах позволяет обеспечивать выход плазмы на

7 — 8- цневных цыплятах с титрами вируса 7 х х10 частиц/мл при стабильных увеличен1 ных ее обьемэх 4,5 мл на обескровлен ого цыпленка.

2001102

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Динамика обескровливания заразившихся 7-8-дневных цыплят при введении технологических доз ВМП

Пассироаание ВМП на 7 — 8-дневных безлейкозных цыплятах породы "Русская белая" разводки НИЛ ЭБМ АМН СССР

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСА МИЕЛОБЛАСТОЗА птиц, включающий внутривенное заражение 7 - 8-дневных цыплят с последующим их обескровливанием и выделением вируссодержащей плазмы, отличающийся тем, что заражение цыплят проводят плазмой цыплят, инфицированных в 3 - 4-суточном возрасте породы "Русская белая". свободной от вирусов лейкоза саркомного комплекса птиц, взятой на 31 пассаже с титром

5 х 10 частиц 1 мл и разведенной до 10

12 в дозе 0,2 мл. 0è»è ь ь

15. 12

1У

1 -7 ф 1

Я 2 р у ф g В 1g 1g ЖФ!82Ю22Я2б2ВЮ о раса цыплят !тменов араяет, ну

Составитель И. Тареева

Техред М.Моргентал Корректор О. Кравцова

Редактор

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3112

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагари э, 101