Способ изготовления ферментного электрода, амперометрически чувствительного к присутствию субстрата фермента

Авторы патента:

C12Q1G01N33/48 -

Использование: в различных областях народного хозяйства и биохимии, где требуется определение, выявление и/или количественное определение компонентов раствора . Сущность изобретения: описан способ получения ферментного электрода, состоящего из однородного гомогенного слоя тонкоизмельченного металла платиновой группы или его оксида, предварительно адсорбированного на поверхность активированного угольного или графитового порошка и осажденного из суспензии на поверхность электропроводной подложки и в смеси с ферментом и необязательно водорастворимым или вододиспергируемым связующим. Ферментные электроды получают покрытием подложки суспензией фермента, тонкоизмельченного металла платиновой группы и угольного или графитового порошка и связующего, если они присутствуют, и сушкой при температуре ниже температуры, при которой происходит инактивация фермента. 14 з.п, ф-лы.. 17 ил, сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4614801/13 (22) 27.07.89 (31) 8817997.3 (32) 28.07.88 (33) GB (46) 23.08.93. Бюл, М 31 (71) Кембридж Лайф Сайенсиз ПЛС (GB) (72) Вильям Генри Муллен (6В) (56) Патент США N. 4229490, кл. С 12 M 1/40, опублик. 1980.

Выложенная заявка Японии М 56163447, кл. G 01 и 27/30, опублик. 1981.

Патент США %4392933, кл. С 12 О 1/00, опублик. 1983. (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА, АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО К

ПРИСУТСТВИЮ СУБСТРАТА ФЕРМЕНТА (57) Использование; в различных областях народного хозяйства и биохимии, где требуИзобретение относится к способу изготовления ферментных электродов и ферментному электроду и к усовершенствованиям в их производстве.

Известны ферментные электроды. способные амперометрически реагировать на каталитическую активность фермента в присутствии соответствующего субстрата и включающие фермент, иммобилиэованный или адсорбированный на поверхности электропроводящего подложечного элемента, который состоит иэ или включает пористый слой связанных полимерной смолой частиц

„„ Ы „„1836428 АЗ (5!)5 С 120 1/00 // G 01 N 33/48 ется определение, выявление и/или количественное определение компонентов раствора. Сущность изобретения: описан способ получения ферментного электрода, состоящего из однородного гомогенного слоя тонкоизмельченного металла платиновой группы или его оксида, предварительно адсорбированного на поверхность активированного угольного или графитового порошка и осажденного из суспензии на поверхность электроправодной подложки и в смеси с ферментом и необязательно водорастворимым или вододиспергируемым связующим, Ферментные электроды получают покрытием подложки суспензией фермента, тонкоизмельченного металла платиновой группы и угольного или графитового порошка и связующего, если они присутствуют, и сушкой при температуре ниже температуры, при которой происходит инактивация фермента. 14 з.п, ф-лы., 17 ил, углеорда или графита, причем эти частицы А} тесно перемешаны, или осаждены или ад-; О сорбированы на поверхность индивидуаль- ь ных частиц до связывания с образованием указанного слоя, тонкоизмельченный ме- Q(} талл платиновой группы, с образованием тем самым пористого подложечного слоя, на котором указанный фермент адсорбируется йли иммобилизуется, причем формируется существенно гомогенный слой связанных полимерной смолой частиц углерода или графита, а указанный металл платиновой группы существенно однородным образом

1836428 диспергирован в указанном слое. Предпочтительными материалами-субстратами являются связанные смолой платинизированные углеродо-бумажные электроды, включающие платинизированные частицы углеродного порошка, на поверхности которых адсорбирова- . на коллоидная платина и которые связаны на углеродо-бумажном субстрате с использованием синтетической смолы, предпочтительно политетрафторэтилена в качестве связующего. Предпочтительными ферментными электродаа м и я влр ются .гл ю козоо ксидазн ые электроды, включающие глюкоэооксидазу, адсорбиро ванную или иммобилизованную на поверхности субстрата, Производство таких связанных смолами платиниэированных углеродных материалов газодиффузионных электродов описывается в патентах США N А-4044193, А-4166143, А-4293396 и А-4478696. Альтернативные, но сходные материалы газодиф фузионных электродов, в равной мере пригодных в соответствии с описанием международной патентной публикации М

WO 87/07295 в качестве электропроводных материалов-субстратов для ферментных электродов, описываются также в патенте

США Ы А вЂ” 4229490. В расширенном изложении, подобные электродные материалы изгнотавливаются осаждением коллоидных частиц платины или палладия, или другого металла платиновой группы, на тонкоизмельченньте частицы углерода или графита, смешиванием платинизированных или палладизированных частиц углерода или графита с фторуглеродной смолой, предпочтительно политетрафторэтилена, и формированием смеси на электропроводной подложке, предпочтительно электропроводной углеродной бумаге, или на ленте волокнистого углерода.

Аналогичные процедуры применимы к материалам, содержащим оксид.

Патент США N 4392938 на имя Накамуры и др, {заявитель вЂ” фирма "Мацусита электрикл индастриал Ко., Лтд.") описывает иммобилизованно-ферментный электрод, включающий оксидо-редуктазный фермент, например гликозооксидазу, и оксид металла, например оксид рутения, способный вступить в окислительно-восстановительную реакцуию и связанный с ферментом, фермент и оксид металла, причем оксид металла либо сам образует коллектор электронов и проводник, либо включен в коллектор электронов и материал проводника, такого как графит. При использовании графита в качестве коллектора электронов и проводника, реактивный оксид металла, например

50 ферментных электродов, включающих фермент или смесь ферментов, иммобилизованных или адсорбированных на пористом слое связанных полимерной смолой платинизированных или палладизированных (или покрытых другим металлом платновой группы) частиц углерода или графита, высокотемпературное связующее (т.е. имеющую высокую температуру плавления фторуглеродную или другую гидрофобную смолу, предпочтительно политетрафторэтлиен) может быть полностью или частично вытеснено или заменено низкотемпературным, предпочтительно водорастворимым или вододиспергируемым связующим, таким как желатин, то есть связующим, которое может быть активировано при комнатной температуре, и не требует высокотемпературного спекания.

Это существенно упрощает производство ферментных электродов, поскольку теперь

Ru02 в порошковом виде и графитовый порошок формуют прессованием в виде порошковой таблетки или диска, на котором фермент, например глюкозооксидазу иммобилизуют сшиванием с поверхностью графита, например глутаральдегидом.

Приведенные способы получения ферментного электрода являются существенно двухстадийными процессами. и требуют предварительного формования графитового или углеродного основания, зачастую в условиях, требующих спекания отформованной таблетки для сплавления связующего, которое, как отмечалось, до сих пор был высокоплавкой гидрофобной синтетической смолой, предпочтительно фторуглеродной смолой, такой как политетрафторэтилен.

Подобные методы, однако, не составляют основы для технологических процессов крупномасштабного, массового производства, в результате чего такие известные ферментные электроды оказываются дорогостоящими. Поэтому было бы жела25 тельным производить такие электроды простым, предпочтительно одноступенчатым методом массового производства. что привело бы к снижению производственных издержек в такой даже степени, чтобы можно

30 было производить одноразовые, выбрасываемые ферментные электроды, которыми можно было бы пользоваться только один раз, а затем выбрасывать. Подобные одноразовьте ферментные электроды могли бы

35 найти широкое применение для множества областей медицинской диагностики и тестов.

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что в производстве

1836428 появляется возможность предварительно смешивать фермент или смесь ферментов с платинизированными или паяладизированными (или содержащими другой металл платиновой группы) частицами углерода или 5 графита в жидкой суспензионной среде, например в воде, и при необходимости содержащими связующее, с образованием тем самым суспензии фермента, платинизированных или палладизированных-тонкоизмельченных частиц углерода или графита, и при необходимости связующим, с последующим осаждением или отложением этой суспензии, например методом шелкографии, в виде тонкой пленки на поверхности электропроводного субстрата, с последующей сушкой покрытого субстрата для нанесения на нем тем самым тонкой пленки, включающей гомогенизованную смесь фер- 2 мента, платинизированного или палладизированного танкоизмельченного углерода или графита, и при наличии вЂ” связующего.

Технология трафаретной печати или шелкографии, в частности, позволяет добиться крупномасштабного производства высокоэффективного и высокочувствительного фрементоэлектродного материала.

Вместе с тем было обнаружено, что хотя присутствие тонкоизмельченного углерода или графита и предпочтительно для выполнения функции коллектора электронов и проводника, в действительности без него можно обойтись, и функциональные ферментные электроды могут быть получены простым осаждением суспензии тонкоизмельченного металла платиновой группы или соответствующего оксида, фермента и при необходимости низкотемпературного, 40 предпочтительно водорастворимого связующего, на электропроводную дорожку, например углеродную дорожку, или другую подходящую электропроводную подложку, такую как лист электропроводной углерод- 45 ной фольги, и сушкой для осаждения на ней однородного слоя, включающего тонкоизмельченный металл платиновой группы или оксид, и фермент, а в случае применения, и связующего в виде существенно гомоген- 50 ной дисперсии.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения, поэтому, предлагается способ изготовления ферментных электродов, включающих существенно гомогенную 55 смесь тонкоизмельченного металла платиновой группы или его оксида. и одного или большего числа ферментов, осажденных в виде электропроводного слоя на поверхности подложки, причем электрод амперометрически реагирует на активность фермента, когда содержащий фермент слой электрода находится в контакте с соответствующим субстратом для фермента, причем способ включает формирование существенно однородной суспензии, включающей тонкоизмельченный металл платиновой группы или

его оксид и указанный фермент(ы), взвешен ные в жидкой суспензионной среде, осажде ние этой суспензии на поверхности подложечного элемента, и сушку осажденной суспензии при температуре ниже температуры инактивации фермента с осаждением тем самым тонкоизмельченного металла платиновой группы или оксида и указанного фермента(ов) в виде существенного однородного, гомогенного покровного слоя на поверхности подложки, В вышеописанном способе совершенно очевидно, что сушка покрытой подложки осуществляется при температуре ниже той, при которой наблюдается сколько-нибудь существенная инактивация фермента, предпочтительно при комнатной температуре.

Согласно изобретению электрод может быть образован с помощью осаждения вначале тонкоизмельченного металла платиновой группы или его оксида, при необходимости предварительно адсорбированного на тонкоизмельченном углероде или графите или подмешанного к нему, при наличии некоторого связующего или без него, на поверхности электропроводной подложки сходным образом, например путем нанесения жидкой суспензии, включающей тонкоизмельченный металл платиновой группы или его оксид, при необходимости предварительно адсорбированный на тонкоизмельченные частицы углерода или графита или подмешанный к ним, в суспензионной среде, предпочтительно водной среде, с последующей сушкой. После этого высушенный слой пропитывают вторым раствором, включающим фермент и при необходимости дополнительное связующее, для диспергирования тем самым фермента в осажденном слое, содержащем тонкоизмельченную платину или окись платины, или другого металла платиновой группы или его оксида, с последующей повторной сушкой конечного продукта.

Вместо использования металла платиновой группы в тонкоизмельченной элементной форме могут использоваться соответствующие оксиды, такие как оксид платины или палладия. Тем самым все ссылки на платинизированный или палладизированный материал в данном контексте следует трактовать как охватывающие мате1836428 риал, содержащий соответствующий оксид, если в контексте нет иных указаний.

Еще неожиданнее оказалось, что можно избавиться от фторуглеродного полимерного связующего или заменить его низкотемпературным, предпочтительно водорастворимым или вододиспергируемым связующим, но можно избавиться также и от тонкоизмельченного углерода или графита. Так, ферментные электроды могут быть теперь получены при составлении их просто из смеси фермента или смесевых ферментов, и тонкоизмельченного металла платиновой группы, или оксида соответствующего металла, оса>кденых с помощью связующего или без него на поверхность электропроводной углеродной бумаги, или на электоопроводную дорожку. При условии совместимости с ферментом могут использоваться и другие электропроводные подложки. В контакте с ферметным субстратом при заданном пре вышении потенциала такие электроды обеспечивают хорошую амперометрическую характеристику, для которой выходной ток прямо пропорционален концентрации субстрата в широком диапазоне концентрации.

Такие ферментные электроды, и прочее, описанное здесь, являются полезными в качестве биодатчиков в широком объеме применений, особенно в области медицинской и ветеринарной диагностики для измерения концентрации ферментного субстрата, например глюкозы, лантата, холестерина в широком ассортименте медицинских и клинических проб, В соответствии с технологическими аспектами изобретения возмо>кно использование множества других методов печати или нанесения покрытий, помимо трафаретной печати при нанесении смеси фермента, тонкоизмельченного металла платиновой группы или его оксида, при необходиМости адсорбираванного на поверхности тонкоизмельченных частиц углерода или графита, и необязательно содер>кащей дополнительное связующее, на поверхность электропроводной подложки. Помимо традиционных методов нанесения покрытий, например с применением ракли или валика, и смеси, содержащие фермент и тонкоизмельченный металл платиновой группы или его оксид, могут быть отпечатаны на поверхности подложки такими известными методами печати, как красочная или тампопечать, Согласно изобретению, ферметные электроды могут быть получены осаждением, например трафаретной печатью, на поверхность электропроводной подложки

55 тонкой пленки тонкиэмельченных частиц металла платиновой группы или его оксида, необязательно адсорбированного на поверхности тонкоиэмельченного углерода или графита и необязательно в смеси с ниэкотемпературным связующим, причем связующее способно связывать частицы в сплошной слой на поверхности подложки без сплавления или спекания связующего, с последующим пропитыванием осажденного слоя ферментом или смесью ферментов.

Хотя предпочтительные тонкоизмельченные углеродные и графитовые материалы изобретения представляют собой тонкоизмельченные активированные частицы углерда или графита, имеющие тонкоизмельченные частицы элементного металла платиновой группы, например, платины, палладия, иридия или радия, а предпочтительно платины или родия, адлсорбированные на поверхности углердных частиц, или в смеси с ними, вместо них могут использоваться соответствующие оксиды, например оксид платины, палладия и родия. Следовательно, термины "платинизированные" и

"палладизированные" в использованном здесь виде охватывают оксиды, если контекст не предусматривает иного. Кроме того, термин "активированный" углерод и "активированный" графит относятся. к "высокопористым угольным и графитовым материалам с большой площадью поверхности, получаемым, например тепловой обработкой угольного или графитового порошка в токе С02 с получением продукта с высокой площадью поверхности, обычно именуемого.в данной области техники "активированным углем".

Площадь поверхности таких активированных материалов может составлять не менее

10 м /r: обычно 200-600 м /г, Размер час2 2 тиц не является критическим фактором, но предпочтительны угольные или графитовые порошки, имеющие размер частиц в диапазоне 3-150 нм, более предпочтительно 3-50 нм.

Количество металла платиновой группы или его оксида, адсорбированное на угольном порошке. в общем случае достаточно для загрузки металла платиновой группы в количестве 0,1-20 мас., в расчете на массу углерода, предпочтительно 0,5-5, Однако эти пределы определены скорее практическими соображениями, недели их критичностью; ниже 0,1 выходной сигнал снижается ниже уровня, который с практической точки зрения является слишком малым для измерения, за исключением применения сверхчувствительного измери1836428

10 тельного оборудования. Выше 20;,, загрузка металлом платиновой группы становится неэкономичной при появлении малой дополнительной выгоды относительно увеличенного отклика или увеличенной чувствительности, Предпочтительно частицы металла платиновой группы или его окислов имеют размер от 1 нм до 20 мкм, а наиболее предпочтителен размер коллоидных частиц в интервале от 1 до 4 нм.

При использовании связующего в ферментных электродах, согласно настоящему изобретению, может применяться либо подходящее низкотемпературное связующее (т,е. способное связывать смесь платинизированного или палладизированного угольного или графитового порошка и фермента при комнатной температуре без нагревания для сплавления связующего), Предпочтительны водорастворимые или вододиспергируемые материалы; особенно гидроксиэтилцеллюлоза или желатин, но другие подходящие связующие включают производные крахмала и целлюлозы, например ацетат крахмала, ацетат целлюлозы, бутират-ацетат целлюлозы, и этилцеллюлоза, и водорастворимые синтетические и полусинтетические полимеры, например поливиниловый спирт, поливинилпирролидон. Используемое количество связующего может колебаться от 5 до 100 в пересчете на сухую массу, и на совокупную массу фермента и платинизированного или палладизированного угольного порошка, предпочтительно от 20 до 50%.

Хотя ферментные электроды, описанные здесь, могут классифицироваться как безмедиаторныег, все же возможно введение индикатора переноса электронов, такого как ферроцен, при необходимости, в суспензию, используемую для образования электрода.

Хотя смесь платинизированного или палладизированного угольного порошка и фермента, предпочтительно, суспензируется в воде до ее нанесения на электропроводную подложку, например трафаретной печатью, все же возможно использование других подходящих жидкостей, включая органических растворителей, например циклогексанона или дихлорметана, в качестве суспенэионной среды. При осаждении на электропроводной подложке толщина покрытия может колебаться от 5 до 500 мкм, Ферментная загрузка может колебаться в широком диапазоне в зависимости от используемого конкретного фермента или смесевого фермента. В случае гликозооксиванем уриказы, сам мочевокислотный суб45 страт подвергается электрохимическому окислению на базовом электроде, маскируя в значительной степени тем самым возможный эффект фермента. Однако, другие подходящие оксидоредуктазы включают

50 лактатоксидазу, галактоэооксидазу, колестериноксидазу и прочие вырабатывающие перекиси ферменты, а также сочетания иммобилизованных ферментов, включая сочетания неоксидазы и оксидазы, причем

55 первая воздействует на рассматриваемый субстрат для получения окисляемого субстрата для оксидаэы, а последняя воздействует на окисляемый продукт с появлением измеримого тока, который пропорционален

40 дазы удовлетворительной может быть сочтена загрузка 10 вЂ” 5000 мкг/см поверхности

2 электрода, причем предпочтительна загрузка

100-2000 мкг/см .

Что касается электропроводной подложки, то может использоваться множество различных материалов, например платиновая или иная электропроводная металлическая лента, пленка электропроводного синтетического полимера, но наиболее предпочтительно использование в качестве подложки электропроводной угольной бумаги или угольной дорожки, то есть линии угольных частиц, осажденных на напроводящую подложку, как это коммерчески реализуется в данной области техники.

Как правило, но не обязательно, поверхность ферментного электрода физически защищается нанесением подходящей пористой, например поликарбонатной, мембраны или экрана, который должен быть, естественно, проницаемым для ферментного субстрата (глюкозы), который предполагается определять. Такие мембраны вносят некоторые осложнения иэ-за увеличения постоянной времени датчика, но тем не менее даже при наличии такой мембраны предлагаемые датчики характеризуются постоянными времени, сопоставимыми и во многих случаях существенно лучшими, чем у традиционных ферментных электродов, Как уже упоминалось, изобретение конкретно относится к гликозооксидазным электродам, т.е. в которых иммобилизованным ферментом является гликозооксидаза, но совершенно очевидно, что возможно использование других оксидоредуктаз, хотя не всегда с достижением эквивалентного эффекта. Это не обязательно обусловлено имманентной неэффективностью фермента, но и другими факторами. Например, при определении мочевой кислоты с использо1836428

30 концентрации рассматриваемого субстрата, Одним таким сочетанием является комбинация бета-галактозидазы и глюкозооксидазы (для количественного определения лактозы), или комбинация бета-глюкан-деполимеризационного фермента, бета-глюкозидазы и глюкозооксидазы (для определения бета-гл юка нов).

Другие типы применения датчика включают использование ферментных или неферментных реагентов или процессов, которые взаимодействуют с первичным субстратом, представляющим интерес в реакции предшественника, причем результирующий продукт включает вещество, которое в свою очередь действует как субстрат для ферментного электрода согласно настоящему изобретению. В области иммунохимических реакций можно найти многочисленные примеры таких стадий вЂ” предшественников, и методы использования таких реакций при построе нии датчиков с использованием ферметных электродов согласно настоящему изобретению очевидны специалистам в рассматриваемой области техники, Однако, первичным применением электродов согласно изобретению являются биодатчики для выявления и/или количественного измерения окисляемого субстрата, особенно глюкозы, в пробе, особенно клинической пробы, такой как кровь, сыворотка, плазма, моча, пот, слезы и слюна.

Другие возможные, неклинические применения включают: (а) контроль и роцесса ферментации (б) управление промышленно-технологическими процессами (в) экологический мониторинг, например контроль отходящих потоков и загрязнения жидкостей и газов (t) проверка пищевых продуктов (д) ветеринарные применения, особенно связанные с указанными выше клиническими применениями.

В связи с тем, что биологические и другие датчики, включающие ферментно-электродный материал согласно настоящему изобретению, могут включать другие конструктивные элементы, электропровода, электронепроводщие (изоляционные) подложки или зонды и т.п., то такие элементы конструкции являются традиционными и подробно их рассматривать нет смысла, Электрический контакт с электродным материалом может быть обеспечен многими путями, например монтажом электродного материала встык с электропроводным контактом или клеммой, например из платины или другого подходящего проводника.

При использовании, выходной ток ферментных электродов согласно настоящему изобретению в присутствии пробы, содержащей ферментный субстрат, измеряется при заданном потенциале в соответствии с процедурами, уже хорошо отработанными в рассматриваемой области техники, Вообще говоря, выходной ток замеряется при заданном потенциале в интервале 200--600 мВ относительно серебра/хлоридсеребряного электрода сравнения, Фиг. 1 вЂ” 17 иллюстрируют выходной ток различных ферментных электродов, построенных в соответствии с изобретением.

Пример 1. Глюкозооксидазный электрод получают суспендированием 200 мг платинизированного угольного порошка, содержащего приблизительно 10 масс. платины, и получаемого у фирмы "Прототек компани", г. Н ьютон Ха йлэндс, ш т, Массачусетс(угольный порошок "Вулкан XC вЂ” 72", номинальный размер частиц 30 нм, имеющий адсорбированные коллоидные частицы платины размером l,5-2,5 нм) в 400 мкл фосфатного буфера (ИаНрРО, 2 ммоль/л; йарНРОд, 16 ммольlл; MaCf, 100 ммоль/л;

К2Н2 (ЭДТУК) 2 Н20, 1 ммольlл; рН 7,4), K суспензии затем добавляют 40 мг глюкозооксидазы, Суспензию перемешивают и оставлячот отстаиваться в 1 Ч при комнатной температуре, После отстаивания суспензию распределяют вручную в виде тонкой пленки на поверхности листа злектропроводной угольной бумаги и оставляют сушиться при комнатной температуре, После сушки ферментно-электродный материал вырезают в виде дисков 1,5 мм и испсытывают для определения их вольт-амперной характеристики на глюкозу при 400 мВ относительно Ag/AgCI в двухэлектродной электрохимической ячейке в том виде, как это описано в публикации М ЮО

87/07295 со ссылкой на фиг, 16, Выходной,ток (мкА) электрода при различных концентрациях глюкозы представлен на фиг. 1 сопровождающих чертежей.

Полученные результаты демонстрируют два примечательных эффекта: во-первых, электродная характеристика является существенно линейной в широком диапазоне от 0 до 30 ммоль/л гликозы, и во-вторых, эти результаты получены без какого-либо связующего для получения "обогащенной кислородом" атмосферы. Согласно известной публикации N. WO 87/07295 в прошлом было возможно добиться линейности лишь в ограниченном диапазоне концентраций

1836428

40 глюкозы, например 2 вЂ” 5 ммоль/л (JaoT/., Analytica chimlca Acta. 148, 27 вЂ” 33 (1983)), Далее, известные публикации указывают, что линейность характеристики глюкозных электродов возрастает, когда допускается свободная диффузия кислорода (Lobel Е., Rishpon J. Analytical Chemistry, 53, 51 вЂ” 53 (1981)), что подтверждено в ЧЧО 87/07295 при использовании связующего, имеющего высокое сродство к кислороду или высокую растворимость кислорода. В отличие от этого, настоящее изобретение обеспечивает линейность характеристики в гораздо более широком диапазоне концентраций глюкозы, даже при отсутствии связующего.

Пример 2. Повторяют пример 1, но с использованием тонкоизмельченного платинизированного графита (5% Pt}, полученного от фирмы "Джонсон Мэтти кемиклз", г, Ройстон, Великобритания, которая поставляет его в качестве "технологического катализатора" СН159б9/01, вместо платиниэированного продукта "Вулкан ХС вЂ” 72". Получена существенно аналогичная линейная электродная характеристика (см. фиг. 2).

Пример 3. Пример 2 повторяют, то есть с использованием тонкоизмельченного плэтинизированного графита (5% Pt), пол. ученного от фирмы "Джонсон Мэтти", с образованием суспензии фермент/Рт-графит.

Однако в этом случае и суспензии добавляют

20% (мас./об.) раствор желатина в воде, охлажденной до 37 С, при обьемном отношении 2:1. 3

Результирующий электрод, полученный распределением желатинсодержащей пасты на подклеечной бумаге "Торэй", дает после сушки при комнатной температуре более прочный продукт, но также характеризующийся существенно линейной характеристикой относительно глюкозы {см. фиг, 3).

Пример 4. Водную пасту получают из

45 мг платинизированного угольного по- 4 рошка (" Вулкан ХС вЂ” 72", содержащий 10 масс. % адсорбированной коллоидальной платины, фирма "Прототек компани", шт, Массачусетс), 5 мг глюкозооксидазы, взвешенной в 100 мг 10% раствора гидроксиэ- 50 тилцеллюлозы в 0,1 M KCI. Пасту вручную наносят на предварительно смоченную угольную бумагу (подклеенная бумага "Торэй") и оставляют высушиваться.

Из высушенного электродного материэ- 55 ла вырезают диски 1,5 мм и их испытывают нэ определение характеристики относительно глюкозы в 2-электродной ячейке, как это описано выше, и при потенциале 400 мВ в сравнении с Ag/AgCI.

Выходной ток измеряют при различных концентрациях гликозы и результаты представлены на фиг. 4. Характеристика существенно линейна в диапазоне концентрации глюкозы от 0 до 3 ммоль/л, Пример ы 5и б. Процедуру примера

4 повторяют, но с платинизированным угольным порошком (" Вулкан ХС вЂ” 72"), содержащим 1% и 0,2% платины, соответственно. Выходные токи электродных материалов измеряли при тех же условиях и результаты представлены нэ фиг. 5 и б. Фиг.

5 демонстрирует сходную линейную характеристику относительно концентраций глюкозы во всем диапазоне от 0 до 30 ммоль/л.

При уменьшенном количестве платины (0,2%) обеспечивается существенная степень линейности, но в более узком диапазоне концентраций от 0 до 20 ммоль/л.

Пример 7. Пример 7 повторяют, но используя 0,5 мг глюкозооксидэзы. Выходной тон электродного материала, измеренный при тех же условиях, приведены на фиг, 7. Линейность сохраняется в диапазоне концентраций глюкозы от 0 до 20 ммоль/л.

Пример 8, Пример 4 повторяют, но используя 45 мг угольного порошка (" Вулкан

ХС вЂ” 72"), содержащего 10 масс, % коллоидального оксида платины, адсорбирован ного на нем, вместо металлической платины.

Диски 1,5 мм из электродного материала испытывают на их характеристику относительно различных концентраций глюкозы при тех же условиях, что и ранее, то есть в

2-электродной ячейке при потенциале 400 мВ в сравнении с Ag/AgCI. Выходной ток измеряют при разных концентрациях глюкозы, что представлено на фиг. 8.

ll р и м е р 9. Пасту получают смешиванием 5 мг платиновой черни, 400 мг активированного угольного порошка (" Вулкан

ХС-72"), 5 мг глюкозооксидазы в 100 мг гидроксиэтилцеллюлозы (10%) в 0,1 M KCI, Пасту распределяют вручную на подклеечной бумаге "Торэй" и оставляют высыхать.

Из высушенного электродного материала вырезают диски 1,5 мм и их испытывают для определения их характеристики относительно глюкозы при тех же условиях, что и, выше.

Электрод дает линейную характеристику относительно глюкозы в широком диапа-. зоне концентраций от 0 до 30 ммоль/л.

1836428

Пример 10, Пример 4 повторяют, но используя 5 мг лактат-оксидазы EC 1,1,3,2 вместо глюкозооксидаэы.

Диски 1,5 мм высушенного электродного материала испсытывают на их характеристику относительно лактата при тех .же условиях, что и ранее: 2-электродная ячейка при 400 мВ в сравнении c Ag/AgCI.

Как показано на фиг. 10, выходной ток изменяется существенно линейно в зависимости от концентрации лактата в диапазоне концентрации лактата от О до 20 ммоль/л.

Л р и м е р 11. Безугольный ферментный электрод готовят суспендированием 5 мг платиновой черни, 5 мг глюкозооксидазы в

100 мг 10% гидроксиэтилцеллюяозы в 0,1 M

KCl.

Суспензию вручную распределяют по подклеечной бумаге "Торэй" и сушат.

Диски 1,5 мм высушенного электродно"го материала испытывают описанным выше образом для определения электродной характеристики, выходного тока, на различные концентрации глюкозы. Результаты представлены на фиг. 11 и дают существенно линейную характеристику в диапазоне концентраций глюкозы от 0 до 20 ммоль/л.

Пример 12. Следуя той же общей методике, что и в примере 4, но с использованием частиц активированного угля ("Вулкан ХС вЂ” 72"), на которых адсорбирован 1 мас. % (B пересчете на массу угля), соответственно, тонкоизмельченных коллоидальных частиц иридия и радия, вместо платинизированного угольного порошка, и с использованием фосфатного буфера (см. пример 1 в отношении подробностей суспензионной среды) вместо 0,1 М KCI. готовят глюкозооксидаэные электроды, состоящие из гомогенного слоя родий- или иридийсодержащих частиц графита и глюкозооксидазы, связанные гидроксиэтилцеллюлозой на подло>кечном слое угольной бумаги. Характеристика такого электродного материала, вырезанного в виде дисков

1,5 мм, измеренная в микроамперах, на концентрации субстрата (глюкозы) в диапазоне от 0 до 40 ммоль/л при 400 мВ в сравнении с Ag/AgO-электродом, показана на фиг. 12 и 13, соответственно (фиг. 12 вЂ” иридий; фиг, 13 вЂ” радий). И вновь получают существенно линейную характеристику, Особенно следует отметить высокий уровень характеристики, получаемый в случае родия.

Пример 13. 8 мг холестериноксидазы (-16 мкм/мг) смешивают со 150 мкл 5% (мас,/об.) гидроксиэтилцеллюлозного рас5

30 твора в фосфатном буфере (йаН2Р04) 1,6 ммоль/л; йа2НР04 5,3 ммоль/л; NaCI 52 ммоль/л; ЭДТУК 0,15 ммоль/л; рН 7,4) до растворения. Добавляют 72 мг тонко измельченного платинизированного графита (5% Pt) и смешивают с образованием пасты.

Электропроводную угольную бумагу ("Торэй"), вымоченную в течение 2 недель в фосфатном буфере (йаН2Р04 2 ммоль/л; йа2НР04 16 ммоль/л; NBCI 100 ммоль/л;

ЭДТУК 1 ммоль/л; тритон Х100(ПАВ) 0,1 об.

%; рН 7.4), промокают насухо и холестериноксидазо/платинизированно-графитовую

/ГЭЦ-пасту равномерно распределяют на ней вручную. Результирующий электрод с нанесенной пастой сушат при комнатной температуре 2 ч и при 30 С в течение 30 мин.

Для улучшения сохранности при хранении электрод затем погружают в 5% (масс./об.) раствор сахарозы на 2 мин и сушат при 20 С в течение 1 ч.

После сушки электрод с нанесенной пастой разрезают на диски 1,5 мм и испытывают для определения характеристики относительно холестерина в двух-электродной ячейке при потенциале+340 мВ в сравнении с Ag/AgCI, электрод с нанесенной пастой защищают поликарбонатной ("нуклеоспор") мембраной толщиной 0,05 мкм.

Для испытания стандартные растворы холестерина готовят из исходного раствора холестерина 6 мМ в 22% водорастворимом

j3-циклодекстрине ("Молекьюзол") в фосфатном буфере (фосфат 1 ммоль/л, NaCI 100 ммоль/л, ЭДТУК 1 ммоль/л; рН 7,4) при нормах разбавления, дающих стандартные концентрации 0,5; 1, 2, 4 и 6 ммоль/л, Выходной ток в мкА представлен на фиг.

14, и демонстрируется существенно линейная характеристика относительно концентраций холестерина в диапазоне 0-6 . ммоль/л.

Пример 14. Ферментные электроды согласно изобретению получают с использованием неводных систем следующим образом, Пастообразные суспензии получают с использованием IO мг количество глюкозооксидазы и 40 мг количеств платинизиро" ванного графитового порошка (5% Pt) в неводной связующей системе следующим образом: (а) 400 мкл 10% (мас./об.) ацетата целлюлозы s циклогексаноне (б) 600 мкл 5% {мас./об.) ацетат-бутирата целлюлозы в дихлорметане;

{в) 400 мкл 5% (мас./об.) этилцеллюлозы в циклогексаноне.

1836428

После смешивания пасты распределяют на электропроводной угольной ("Торэй") подклеечной бумаге и оставляют сушиться при комнатной температуре.

После сушки из покрытой подклеечной бумаги вырезают диски диаметром 1,5 мм и их испытывают на их характеристику относительно глюкозы в двухэлектродной ячейке при 340 мВ в сравнении с Ag/AgCI.

Электродный материал устанавливают на золотом рабочем электроде и закрепляют на нем с помощью поликарбонатной (нуклепор) мембраны толщиной 0,03 мкм, Используют стандартные растворы глюкозы, . содержащие 0; 2.5; 5; 10 и 20 ммоль/л глюкозы в фосфатном буфере, содержащем

NaHzP04 2 ммоль/л; N32HP0< 16 ммоль/л;

NaCI 100 ммоль/л; ЭДТУК 1 ммоль/л и рН

7,4. В каждом случае выходной ток, измеренный в мкА, выдаваемый ячейкой, графически представлен на фиг. 15 вЂ” 17.

Фиг. 15 вЂ” ацетат целлюлозы в циклогексаноне;

Фиг, 16 вЂ” ацетат-бутират целлюлозы в дихлорметане;

Фиг. 17- этилцеллюлоэа в циклогесаноне

Эти фигуры чертежей демонстрируют возможность реализации изобретения с использованием неводных систем и альтернативных низкотемпературных связующих, Формула изобретения

1. Способ изготовления ферментного электрода, амперометрически чувствительного к присутствию субстрата фермента, включающий иммобилизацию фермента класса оксидоредуктаз на электропроводящую подложку s присутствии частиц металла или Оксида металла коллоидного размера, отличающийся тем,что иммобилизацию проводят путем формирования суспензии фермента и частиц металла или его оксида коллоидного размера, нанесения ее на электропрводящую подложку и высушивания.

2. Способ по и. 1. от л и ч а ю шийся тем, что используют частицы металла или его оксида с размером.1-4 нм.

3. Способ по и. 1, отличающийся тем, что в суспензию добавляют активированный уголь с размером частиц 3 вЂ” 150:нм, 4. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и5 и с я тем, что металл или его оксид используют в виде частиц коллоидного размера. адсорбированных на активированном угле с размером частиц 3-150 нм, 5. Способ по п.4, о тл и ч а ю щи и с я

10 тем, что содержание металла или его оксида составляет 0.2-10 мас. $ от массы активированного угля.

6. Способ по пп. 1-5, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в суспензию добавляют низкотемпературное полимерное связующее, 7. Способ по пп. 1-6, о тл ич а ю щи йс я тем, что суспензию готовят в водном буфере.

8, Способ поп.7,отлич а ю щи йс я тем, что в качестве низкотемпературного полимерного связующего используют желатин или гидроэтилцеллюлоэу.

9. Способ по пп. 1 вЂ” 6, отл и чаю щи йс я тем, что суспенэию Готовят a opraw eском растворителе.

10. Способ поп.б, отл и ча ю щийся тем, что в качестве ниэкотемпературного полимерного связующего используют аце30 тат целлюлозы, ацетат-бутират целлюлозы или этилцеллюлозу.

11. Способ по пп. 1-10, отл ичаю щий с я тем, что в качестве фермента класса оксидоредуктаз используют глюкозоокси35 дазу, холестериноксидазу или лактатоксидазу.

12. Способ no nn. 1-11, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что в качестве металла или его оксида используют платину, иридий. или ро40 дий. или их оксиды.

13. Способ по пп. 1-12, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что в качестве электропроводящей подложки используют электропроводную бумагу или угольную дорожку.

45 14. Способ по пп. 1-13, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что суспенэию наносят на подложку методом печати.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что суспензию наносят на подложку ме50 тодом трафаретной печати, Ф

Ю 20

HM0Ab/У ГАЮ ЮЫ

Фиг. 1 д

10 О мль/л мяты

Фиг. 3

1836428 йип ь|л гл окозы

Фиг..4

Миола л гяокозы

Фиа 5

0 Z0 лгюоль/о глюкози