Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis var.кursтакi для получения инсектицидного препарата против насекомых отряда lерidортеrа

 

Использование: производство средств защиты растений от вредных насекомых. Сущность изобретения. Штамм бактерий Bacillus thurlnglensls var. kurstakl депонирован в коллекции штаммов Департамента сельского хозяйства США под Nfe C1В12570. Штамм выращивают на среде, содержащей пептонный бульон - 8 мл; глюкозу - 6 г; дрожжевой экстракт - 5 мл; ксилозу - 0,5 г; экстракт муки хлопковых зерен - 30 мл; кукурузный экстракт - 3,2 мл; раствор солевой смеси Мери Мендель - 1 мл. При перемешивании и температуре 30°С полученную биомассу, споры и кристаллы отделяют центрифугированием, суспендируют в 100 мл воды, затем в суспензию вносят последовательно диспергатор 4,9 мл Morwet D-425, суспендирующий агент 4.9 мл veegum HV, смачивающий агент4,9 мл, Твина-80 и 24,4 мл антифриза Sorbo. Данный штамм эффективнее известного НД-1 в 5,1 раза. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СК ИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 А 01 N 63/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

2 (21) 4613284/13 (22) 23.12.88 (31) 8730132 (32) 24,12.87 (33) GB (46) 30,06,93, Бюл. М 24 (71) Империал Кемикал индастриз llflC (GB) (72) Роджер Лорент Берниер (СА), Мартин

Дэвис Коллинз (GB), энн Луис Грей (CA) (56) Авторское свидетельство СССР

М 665684, кл, А О1 N 63/02, 1984. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

THURINGIENSIS VAR, KURSTAKI ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА

ПРОТИВ НАСЕКОМ61Х ОТРЯДА LEPIDOPTERA (57) Использование: производство средств защиты растений от вредных насекомых, Сущность изобретения. Штамм бактерий

Изобретение относится к получению средств защиты растений от вредных насекомых, в частности, отряда Lepldoptera u касается нового штамма бактерий Bacillus

thurlngtensis var, kurstakl для получения инсектицидного препарата.

Цель изобретения — получение нового штамма. имеющего свойства, аналогичные свойствам HD-1, но обладающего более высокой инсектицидной активностью против ряда чешуекрылых паразитов.

Штамм Bacillus thurlnglensls var.

kurstakl A20 депонирован в Национальном собрании промышленных и морских бактерий под М NC1B 12570.

Штамм А20 выделен из почвы под кедрами в Кобурге, Онтарио. По морфологиче5U 18253ОО АЗ

Васйоз thurlngiensls чаг. kurstakl депонирован в коллекции штаммов Департамента сельского хозяйства CLUA под N. C1B12570, Штамм выращивают на среде, содержащей пептонный бульон — 8 мл; глюкозу — 6 г; дрожжевой экстракт — 5 мл; ксилозу — 0,5 г; экстракт муки хлопковых зерен—

30 мл; кукурузный экстракт — 3,2 мл; раствор солевой смеси Мери Мендель — 1 мл. При перемешивании и температуре 30 С полученную биомассу, споры и кристаллы отделяют центрифугированием, суспендируют в

100 мл воды, затем в суспенэию вносят последовательно диспергатор 4,9 мл Morwet

D — 425, суспендирующий агент 4,9 мл

veegum HV, смачивающий агент 4,9 мл, Твина-80 и 24,4 мл антифриза Sorbo. Данный штамм эффективнее известного НД-1 в 5,1 раза. ским и общим биохимическим свойствам он подобен KD-1. Морфология штамма представлена в табл.1. Для описания морфологии штамма использованы питательный агар Дифко и агаровая основа Bacillus

cereus (код СМ617 из Оксоида, Канада)

Биохимические свойства штаммов сравнены в табл. 2-4.

Штамм растет как на органическом, так и неорганическом источнике азота, При использовании неорганического источника азота в средудополнительно следует внести валин.

С учетом этого сходства оказалось неожиданным, что штамм А20 имеет существенно более высокую ин секти цидную

, 825300

10 активность против ряда чешуекрылых вредителей, чем НО-, Хранение штамма, Штамм А20 может храниться в четырех различных состояниях: суспензия культуры, хранящаяся при - 20 С в глицерине, косой питательный агар при 4" С и суспензия спор, хранящаяся при - 20 С, а для целей долгосрочного хранения культуры — высушенная вымораживанием, хранящаяся при комнатной температуре.

Один из путей осуществления способа по данному изобретению состоит в том, что подверженному поражению насекомыми растению придают свойство вырабатывать д-зндотоксин in situ. Это достигается клонированием гена д-эндотоксина иэ штамма

NC1MB 12570 или 12571 известными способами с использованием подходящего промотора (например, CaMV35S-промтора), вызывающего экспрессию гена в растениях, и трансформированием растений известными способами (например, с использованием

Т-плазмид1, Насекомые, с которыми наиболее эффективно можно бороться способом по данному изобретению, являются чешуекрылыми. например такими, которые приведены в табл. 5.

Способ по данному изобретению можно использовать для защиты широкого набора растений, подверженных заражению чешуекрылыми. Особыми примерами коммерчески важных растений, защищаемых способом по данному изобретению, являютсяя маис (кукуруза) и хвойные деревья, а также рис, зерновые (пшеница и ячмень) и овощи, включая латук. помидоры и сахарную свеклу, Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Выделение штамма

Sacillus thuringlensis чаг kurstaki JClB—

12570 (А20), Образец почвы, взятой под кедрами в

Кобурге, Онтарио, разбавили, поместили 0,5 г образца в бутылку, содержащую 45 мл

0.05 (пептона, Затем образец термически обработали, для чего его поместили на 10 мин в водяную баню с температурой 60"С.

Затем приготовили последовательные разведения, беря по 0,5 мл наиболее разбавленного образца, и помещали его в 4,5 мл

0.05$ пептона (например. при по лещении

0.5 мл разбавления 1;10 в 4,5 мл пептона получают разбавление 1:100), эту операцию повторили до достижения разбавления 10

-5

Селективную среду В, cereus (агаровая основа Baciiius cereus код СМ617 из Oxold, 15

Канада) и зскулиновый агар (содержащий, г/л воды: эскулин 1.0; цитрат железа 0.5, пелтон 10: МаС15; агар 20) заЧевают Чуспензиями, разбавленными от 10 до 10 . Засеянные образцы инкубируют при 30 С 5 дней до получения колоний. Отбирают колонии, имеющие темноокрашенные параспоральные кристаллы, имеющие форму бипирамиды. Кристалл — положительные колонии переносят на питательный агар для получения чистых колоний и инкубируют еще 5 дней при 30 С, Колонии проверяют на присутствие кристаллов и чистоту. Очищенные колонии переносят на скошенный питательный агар и хранят в оефрижераторе при

40 С для дальнейшего использования.

Пример 2. Выращивание штамма, Культуру штамма со скошенного агара засевают в 250 мл колбу Эрленмейера, содержащу;о 100 мл среды CRL М 1 (содержащую, г или мл/л воды; пептонный бульон 8; глюкозу 6; дрожжевой экстракт 5; ксилоэу

0,5; экстракт муки хлопковых зерен 30 мл; кукурузный экстракт 3,2 мл: солевую смесь

Мери Мендель 1 мл). Инкубируют при перемешивании 300 об/мин при 30 С в течение

24 ч. Затем все 100 мл засеяли в 1 л среды указанного состава в 2-х л колбе, инкубировали в течение 5 дней при перемешивании

300 об/мин и 30 С. Форментационный бульон содержит 10 — 10 спор/мл, 6 9

Пример 3. Рецептура по данному изобретению.

После завершения ферментации отделили биомассу — споры и кристаллы от ферментационного бульона центрифугированием или микрофильтрацией, Выделенные споры и кристаллы суспендировали в

100 мл воды и получили жидкий концентрат, добавляя 4,9 Morwet 0-425 (натриевый нафталин-формапьдегидный конденсат) (диспергирующий агент), 4,9 Veegum HV (алюмосиликат магния) (суспендирующий агент), 4,9 мп Tween 80 (смачивающий агент) и 24,4 мл сорбит (антифриз). Каждый ингредиент добавляют по отдельности в укаэанном порядке. Продукт хранят при 40 С до использования. Аналогично получили препарат на основе штамма Н0-1, который использовали в качестве контроля, tl р и м е р 4. Эффективность BT-штаммов А20 для защиты растений от поражения насекомых.

С использованием описанных в примере 3 рецептур на основе смесей спор и кристаллов, штамма А20. полученных как описано в примере 2, провели испытание на эффективность против гусениц листоверт1825300 ки-.почкоеда елового путем опрыскивания листвы. Ветки ели. естественно зараженные насекомыми (личинки в 4-5 возрастной стадии), опрыскали с помощью опрыскивателя модели MRY — 2. Для А20 и HD-1 размер капель (диаметр) равен 20-120 мкм при среднем диаметре 32 мкм. Во всех случаях

В этом примере с точки зрения коэффициента эффективности А20 является в 5,1 раза более активным, чем HD-1, Пример 5. Дополнительные испытания на токсичность А20 по отношению к насекомым — вредителям.

Методика определения инсектицидной активности.

В испытаниях используют личинки

Trichoplusla ni возрастом 4 дня, которые вскармливают в течение 4 дней при 30 С, используя диету Браусвилля для биоиспытаний, не содержащую антибиотика. Минимум двадцать пять 4-дневных личинок T. nl подвергают действию препарата в различной дозировке. Личинки выдерживают четыре дня при 30 С и в течение этого времени определяют смертность. Значение эффективной инсектицидной (стандартной) активности получают на основании по меньшей мере трех значений активности, полученных в испытаниях, в которых групповой нанесли около 11 капель на иголку с концентрацией 30 х 10 1 спор/га. Обработанные ветки инкубировали в камере роста до окукливания. Результаты выражены в виде про5 цента смертности, числу мертвых насекомых (число мертвых насекомых + число живых насекомых х 100), Через 5 дней инкубирования по примеру 3 биомассу, споры и кристаллы отделили центри10 фугированием и осаждали ацетоном. Полученный порошок ввели в искусственный корм, пригодный для испытуемых насекомых. После кормления регистрировали смертность насекомых по стандартной методике. Сравнительные

15 испытания провели с использованием HD-1. коэффициент вариации составляет менее

20 Эти испытания определяются как испытания с минимум пятью точками на кривой. где по меньшей мере две точки

20 находятся выше, а две — ниже ЛК о, значительной регрессией, значимыми значениями F и на 957 достоверными уровнями значимости в менее, чем ЗХ интервале.

Активность штамма NICB — 12570 со25 ставляет 2000-12000 1ч/мг бульона.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringlensls

var. kurstakl NC1B 12570 для получения ин30 сектицидного препарата против насекомых отряда Lepldoptera.

1825300

Таблица 1

Мо ология клеток Мо ология колонии

K исталлы

Штамм HD — 1

Средние бипирамиды Спаренные палочки с и кристаллы неопре- концевыми спорами, деленной формы не раздувающими клетки

HD-1

Бипирамиды от сред- Спаренные палочки и них до крупных и ок- короткие цепочки, на руглые пирамиды концах споры

А20

30ос

240С

34 С растет при рН между 4 и 8, оптимальный рост и и РН70

Таблица 2 р и м е ч а н и е, -отрицательная реакция,+ положительная реакция,(+) частичная реакция.

Таблица 3

Биохимические маркеры на платах ID-IDENT

Оптимальная температура

Минимальная температура

Максимальная температура рН

Лецитиназно отрицательные. круглые колонии. выпуклые желтые центры, диаметр

1,0 см

Лефитиназные отрицательные, форма рваной капли, выпуклые желтые центры

1,Ох0,5 см

Продолжение табл. 3

Лейцинаминопептидаза

Пролинаминопептидаза

И ироглутаминовая кислота

Ариламидаза

Тироэинаминопептидаза

Аргининаминопептидаза

Аланинаминопептидаза

Гистидинаминопептидаээ

Фенилаланинаминопептидаза

Глицин

Каталаза

П р и м е ч а н и е. + частичное изменение цвета трудно идентифицировать) "ID — IDENT" — торговое название фирмы Analytas Products

Таблица 4

Биохимические маркеры на платах API-ZYME

API ANA ТА8 PRODUCTS

Π— реакция отсутствует

+ — положительная реакция

1825300

Таблица 5

Составитель Т.Полянская

Техред М,Моргентал Корректор М.Куль

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2229 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Рэушская наб., 4/5