Штамм гибридомы атсснв 9580 - продуцент антител против гликопротеина

 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для получения моноклонального антитела производного анти-гликопротеина. Цель изобретения создание шта Sptwe i АТССНВ 9580 Способ заключается том. что мыше подвергают двукратно мниуниаации клетками JV среде RP.MI с последующе иммуииаацие дифференцированными миристат-ацетатом форболв метками U 937 а той же среде, клетки селеэеики иммунизированных ммше отбирает и сливают с миеломиыми клетками РЭХбЗАц. 8853 с последующе инкубе цне слившихся клеток в присутствии сложного афнра миристата форболв и клеток JX или SKW-3, надосадочную жидкость, иигибирующую агрегацию клеток JX. подвергают двукратному клоиироеанию с использованием метода ограниченного рваеедения с последующе культивацие клонированных клеток а подходяще среде и выделением конечного продукта. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (и)ю G 01 N 33/531

ГОСУДАРСТВЕН.ЮЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4613981/14 (62) 4355792/13 (22) 17 05.89 (23) 03.05.88 (46) 30.05.93. Бюл. hk 20 (31) 45963 (32) 04.05.87 (33) US (71) Дана Фарбер Кензер Инститют (US) (72) Тимоти Спрингер, Роберт Ротлейн, Стивен Мерлин и Майкел Дастин (US) (54) ШТАММ ГИЬРИДОМЫ АТССНВ 9580—

ПРОДУЦЕНТ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ГЛИКО-.

ПРОТЕИНА (57) Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для получения моноклонального антитела производного анти-гликопротеина. Цель иэобретения—

Изобретение относится к производству моноклональных антител против протеинов, в частности к способу получения моноклонального антитела производного антигликопротеина.

Цель изобретения — получение нового моноклонального .антитела анти-гликопротеина, полезного в областях трансплантации органов, прививки ткани, онкологии и для лечения аллергии, Способ осуществляется следующим образом.

Способ заключается в том, что мышей подвергают двукратной иммунизации клетками JY в среде RPMI с последующей иммунизацией дифференцированными миристатацетатом форбола клетками U937 в той же.,. Ж 1819353 АЗ создание штамма гмбр»демы ЛТССНВ 9580.

Спесеб аавнечеетсю ° тем. чте мыва пед° ерга©т / Toe»ммуи»аац»» клет«ам» JY ° среде RPMI с песледуещей

»ммуи»аац»е1 д»ффере»ц»рева»»ым» м»ре стет-ацетатем фербвм клеткам» U 937

° тМ же среде. клетк» селеае»к»»ммуниз»реве»нык ммее1 етб»реет» са»вавт с клеткаеаю РЗХ63ДЕ. 6653 с послфдуа»ЕМ»»кубац»М сл»е»юхсю клеток в пр»еутста»» слежнеге аф»ра м»р»стата фербем» кюетек JX»ю» SON-3, ицрсцрчМ, 4 клеток JX. педфергают двукратному клон»реааиюе с метщ в огра»»ченного рааееде»»ю с последующей культ»вац»М кле»»реваииых клеток ° педходящей среде» выделен»ем конечного продукта. среде, клетки селезенки иммунизированных мышей отбирают и сливают с миеломными клетками P3X63Ag 8653 с последующей инкубацией слившихся клеток в присутствии сложного эфира миристата форбола и клеток JY или SKW-3, надосадочную жидкость, ингибирующую агрегацию клеток JY, подвергают двукратному клонированию с использованием метода ограниченного .разведения с последующей культивацией клонированных клеток в подходящей среде и выделением конечного продукта.

Пример 1. Получение моноклональных антител к ICAM-1, Иммунизация. Мышей Ва!Ь/С подвергают иммунизации (внутрибрюшинно) 0,5 м

2 х 10 клеток JY в RPMI-среде 103 дня и 24

1819353 дня слияния. На 4-й и 3-й дни до слияния мышей подвергают иммунизации (внутрибрюшинно) 10 клеток 0937, дифференцированных ацетатом форбол-12-миристата (далее "ФМА"), в 0,5 мл среды RPMI.

Дифференцировка клеток 937.

5х 10 /мл клеток 0937(ATCC CRL1593) подвергают дифференцировке инкубацией в среде RPMI, содержащей 10 эмбриональной бычьей сыворотки. 17, глутамина, 50 мкг/мл гентамина и 2 нг/мл ФМА, в стерильных полинропиленовых контейнерах.

На третий день инкубации половину объема среды отбирают и заменяют свежей полной средой, содержащей ФМА. На четвертый день клетки удаляют, промывают и подготавливают к иммунизации.

Слияние..

Клетки селезенки от иммунизованных мышей сливают с миеломными клетками

РЗХ63А9.8653 в соотношении 4;1. После слияния клетки переносят в плоскодонные микротитровальные пластины с 96 углублениями при концентрации 10 клеток селе5 зенки/углубление.

Отбор анти-1САМ-1 положительных клеток.

Спустя неделю 50 мкл надосадочной жидкости подвергают скринингу следующим образом. Клеточные линии JY u SRW-3 два раза промывают средой RPMI 1640, содержащей 5 мМ буфера Гепес, и повторно суспендируют до концентрации 2 х 10 кле6 токая. 50 мкл надосадочного моноклонального антитела добавляют к 50 мкл полной среды RPMI, содержащей 200 нг/мл сложного эфира форбола, ФМА и 100 мкл клеток в концентрации 2 х 10 клеток/мл среды.

При этом получают конечную концентрацию

50 нг/мл ФМА и 2 х 10 клеток на углубление. Клеткам дают осаждаться и определяют степень агрегации в различные моменты времени. Отбирают клетки из надосадочных жидкостей, инкубирующих агрегацию клеток JY, но не агрегацию клеток SKW-З, и клонируют дважды, используя метод ограниченного разведения. В результате этих экспериментов идентифицируют и клонируют три отдельных гибридомные линии, которые продуцируют моноклональные антитела анти-ICAM-1. Антитела, продуцируемые этими гибридомными линиями, обозначают

1962а,!962ь и IgM, соответственно. Гибридомная клеточная линия, которая продуцирует антитела 19G, обозначают R6 5 D6 T9 Â2.

Антитело, продуцируемое предпочтительной гибридомной клеточной линией, обозначают P6 5 D6 Е9 В2 (далее "R6-5-D6").

Гибридомная клеточная линия R6 5 D6 Å9 В2 была депонирована 30 октября 1987 г, в

AmerIcan Typeculture Collection и обозначена АТССНВ 9580.

Получение антитела осуществляют следующим образом, Мышей Balb/С внутрибрюшинно инокулируют 3-10 х 10 клеток.

Несколько дней до инокуляции мышам внутрибрюшинно дают либо неполный состав добавки Фройнда, либо пристан. Через несколько дней собирают образовавшуюся асцитную жидкость и антитело выделяют путем осаждения сульфатом аммония и аффиной хроматографии на связанном с носителем протеине А.

Пример 2. Влияние антитела антиlCAM-1 на пролиферацию человеческих периферических моноядерных клеток крови.

Человеческие периферические моноядерные клетки крови индуцируют для пролиферации с помощью присутствия и распознавания антигенов или митогенов.

Некоторые молекулы, такие как митоген, конканавалин А или связывающие Т-клетки антитело ОКТЗ, вызывают неспецифическую пролиферацию периферических моноядерных клеток крови. Человеческие периферические моноядерные клетки крови являются гетерогенными в том, что они состоят из субпопуляций клеток, которые способы распознавать специфические антигены. Когда периферическая моноядерная клетка крови, которая способна распознавать конкретный специфический антиген, встречается с антигеном, возникает пролиферация такой субпопуляции моноядерных клеток, Токсин столбняка и гемоцианин блюдечка являются примерами антигенов, которые распознаются субпопуляциями периферических моноядерных клеток, но не распознаются всеми периферическими моноядерными клетками у сенсибилированных индивидуумов, Исследуют способность моноклонального тела R6-5-16 анти-ICAM-1 к ингибированию пролифе рации человеческих периферических моноядерных клеток крови в системах, для которых требуется межклональная адгезия.

После очистки периферические моноядерные клетки крови промывают три раза средой RPMI 1640 и культивируют в плоскодонных микронитровальных пластинках с

96 углублениями при концентрации 10 кле6 ток-мл в среде RPMI 1640, дополненной 10 эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глютамина и 50 мкг/мл гептамицина.

Антиген, либо Т-клеточный митоген, конканавалин А (0,25 мкг/мл), связывающее

Т-клетки антитело ОКТЗ (0,001 мкгlмл); гемоцианин блюдечка, (10 гlмл) либо тетанус1819353

Составитель Г. Крюкова

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор E. Папп

Редактор

Заказ 1953 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ного анатоксина (e виде 1: 100 разбавления) добавляют к клеткам, которые культивируют, как описано выше, в присутствии или в отсутствии антитела R6-5-16 (конечная концентрация 5 г/мл). Клетки культивируют.

3,5 дня (эксперимент с конканавалином А), 2,5 дня (эксперимент с OKT3) или 5,5 дней (эксперименты с гемоцианином блюдечка и тетанусным токсидным антигеном).

18 ч до окончания эксперимента к культУРам пРибавлЯют 2,5 мкС; Н- тимидина.

Определяют клеточную пролйферацию путем измерения включения периферическими моноядерными клетками крови тимидина в ДНК. Собирают включенный тимидин и подсчитывают с помощью жидкостного сцинтилляцион ного счетчика.

Было обнаружено, что антитело антиICAM-1 ингибирует в моноядерных клетках пролиферативные ответы к митогену неспецифических Т-клеток, конканавалину А, антигену неспецифических Т-клеток, ОКТ-З, и специфическим антигенам, гемоцианину

5 блюдечка и тетанусному токсоидному антигену. Ингибирование антиадгезионным антителом сравнимо с ингибированием антителом анти-LFA-1. Поэтому можно предполагать, что ICAM-1 является функци10 ональным лигандом LFA-1 и что антагонизм !

САМ-1 будет ингибировать ответы специфических защитных систем.

15 Формула изобретения

Штамм гибридомы АТССНВ 9580.(коллекция American Typeculture Collection

Rochvill М В 20852 USA) — продуцент антител против гликопротеина.