Способ определения авермектинов

 

Сущность изобретения: осуществляется с помощью цветной реакции с орциновь.и реактивом в органической фазе. Реакция между авермектинами и орциновым реактивом протекает в н-бутаноле при 75-85°С в течение 10-20 мин. Максимум поглощения цветного комплекса 630-640 нм. Результаты находят по калибровочному графику, для построения которого используют ивермектин или авермектин Bia. 1 ил., 1 табл.L

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 21/78

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ - . 7г -Фф

К ПАТЕНТУ (21) 4953581/25 . (22) 28,06,9.1 (46) 30.03.93. Бюл. М 12 (71) Малое государственное предприятие

"Бифидум" Научно-производственного объединения "Биотехнология" (72) В,А.Мосин, В.А,Дриняев и M.H.Мирзаев (73) В.А,Мосин, В.А.Дриняев и M.H.Mèðçaeâ (56) Burg ВМ. etc. АУеппесбпз new family of

potent althelmintic agents, Producing

organism and fermentation, Antlmlcrob, Agents Chewother; 1979, 15, р. 361-367.

Патент Швейцарии N 639422, кл. С 12

P 19/62, опублик. 1983;

Изобретение относится к биотехнологии и касается контроля за производством и применение авермектинов, которые применяются в животноводстве, растениеводстве и медицине для борьбы с андо- и экзопаразитами животных, растений и человека.

Цель изобретения — ускорение и упрощение определения авермектинов за счет использования колориметрического метода определения.

На чертеже представлен калибровочный график для определения концентрации авермектинов, построенный в осях

Огузо- С мкг/мл, где Огузо — оптическая плотность при 630 нм, С вЂ” концентрация авермекти нов в растворе, мкг/мл, 1 ивермектин, 2 — авермектин В 1а.

Оптическая плотность для авермектинов в интервале концентраций 2 — 20 мкг/мл подчиняется закону Ламберта-Бера. Определение концентраций стандартных раство"ров авермектинов В1а и инвермектина .по,, Ы,, 1806351 А3 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АВЕРМЕКТИНОВ (57) Сущность изобретения: осуществляется с помощью цветной реакции с орциновь„ реактивом в органической фазе, Реакция между авермектинами и орциновым реактивом протекает в н-бутаноле при 75-85 С в течение 10-20 мин. Максимум поглощения цветного комплекса 630 — 640 нм. Результаты находят по калибровочному графику, для построения которого используют ивермектин или авермектин В». 1 ил., 1 табл, изобретению в соответствии с "ИРАС" пока-, зали, что средняя относительная погреш- ) ность (при и= 5, критерии Стьюдента > а = 0,95) составляет 5-8%, Пример 1, Определение содержания авермектинов и препарате ивермектина фирмы "Мерк". Навеску ивермектина в количестве 10 мг взвешивают на торсионных весах с точностью 2 мг и растворяют ее в

100 мл 96% этанола. К 0,2 и 0,01 мл раствора добавляют 2,8 + 0,1 мл н-бутанола. и 2,0 0,1 мл орцинового реактива (90 мл

0,1% раствора гексагидрата хлорного железа в концентрированной соляной кислоте и

10 мл 5% раствора.орцина в этаноле). Пробы тщательно перемешивают и помещают в водяную баню при 80 1 С на 15 +- 1 мин, охлаждают, после чего колориметрируютпри 630 нм против холостой пробы. Содержание авермектинов находят согласно измеренной оптической плотности по калибровочному графику в мкг/мл. Для по1806351 строения калибровочного графика исполь- ходная навеска имеет вес 94мг, по прототизовали ивермектин фирмы "Мерк" или авер- пу содержание ивермектина в исходной намектин В в концентрации 2-20 мкгlмл. веске составляет 96 мг, Содержание авермектинов составляет Пример 6. Определение содержания

0,98 мкг/мл, следовательно, исходная наве- 5 авермектинов в препаратах ивермектина скаимеетвес9,8мг,Попрототипу исходная фирмы "Мерк". Все процедуры проводят навеска составляет 9,6 мг. так, как это описано в примере 1, за исклюПример 2. Определение содержания чением того, что пробы фотоколориметрируавермектинов в препарате ивермектина ют при 640 нм против холостой пробы. фирмы "Мерк". Все процедуры проводят "0 Содержание авермектинов составляет 0,93 так, как зто описано в примере 1, за исклю- мкгlмл,.т,е. в исходной навеске содержание чением того, что пробы помещают в водя- авермектиновсоставляет9,3мг,попрототиную баню при 75 + 1 С на 20 1 мин. пу вес исходной навески равен 9,6 мг.

Содержание авермектинов составляет 0,94 Пример 7. Определение содержания мкг/мл. Следовательно, исходная навеска 15 авермектинов в препаратах ивермектина имеет вес 9,4 мг, а по прототипу 9,6 мг, фирмы "Мерк,". Навеску ивермектина в колиПример 3. Определение содержания честве 10 мг взвешивают на торсионных веавермектинов в препаратах ивермектина сах с точностью +. 2 мг и растворяют в 100 фирмы "Мерк". Все процедуры проводят мл хлороформа. В дальнейшем поступают так, как это описано в примере 1, за исклю- 20 так, как зто описано в примере 1. Содержачением того, что пробы помещают в водя- we авермектинов составляет 0,93 мкг/мл. ную баню при 85 . 1 С на 10 + 1 мин. Следовательно, исходный вес навески соСодержание авермектинов составляет 0,98 ставляет 9,3 мг против 9,6 мг по прототипу, мкг!мл; что соответствует исходной навеске Пример 8. Определение содержания в 9,8 мг, по прототипу 9,6 мг. 25 авермектина в хроматографически очищен Пример 4. Определение содержания ном препарате .авермектинов серии В из авермектинов в препаратах ивермектина культуральной жидкости S. avermitilts ВКМ фирмы "Мерк". Навеску ивермектина в коли- 1301. Навеску маслянистой субстанции в кочестве 10 мг взвешивают с точностью личестве 100 мг взвешивают на тОрсионных

2. мг и растворяют ее в 100 мл метанола. 30 весах сточностью . ч- 20 мг. После количеОстальные операции осуществляюттак, как ственного перенесения навески в.мерную . описано в примере1. Содержание авермек- . колбу на 100..мл масло растворяют в 98% тинов составляет,0,96 мкг/мл. Следователь- этаноле. Далее ход анализа аналогичен тоно, исходная навеска имеет вес 9,6 мг. С му, как зто описано в примере 1. Содержа- . помощью известного способа определено 35 ние авермектинов в хроматографически

9,6 Mr. очищенном препарате авермектинов серии

Пример 5. Определение содержания В из культуральной жидкости S. avermitills авермектинов в препаратах ивермектина ВКМ АС 1301 составляет 0,85 мкг/мл. Слефирмы "Мерк".Навескуивермектинавколи- довательно, в исходной навеске масляничестве 100 мг взвешивают на торсионных 40 стого препарата авермектинов серии. В весах с погрешностью и 20 мг и раство- содержание авермектинов составляет 85 мг, ряют ee e 100 мл ацетона. С помощью бута- по прототипу определяется 80 мг авермектинола 1 мл полученного раствора разводят в нов в препарате авермектинов серии B.

10 раз. К0.2 + 0,01 мл разведенного рас- Пример 9. Определение суммарного твора добавляют 2,8 +. 0,1 мл орцинового 45 содержания авермектинов в культуральной реактива (90 мл 0,1% раствора гексагидрата жидкости Streptomyces . avermltills BKM AC хлорного железа в концентрированной со- 1301. Культуральную жидкость Streptomyces ляной кислоте и 10 мл 5% раствора, орцина avermitiHs BKM АС 1301 в возрасте 168 часов в этаноле). Пробы тщательно перемешива- в количестве 10 мл центрифугируют при 3000 . ют и помещают в водяную баню при 50 оборотах вминутувтечение20мин. Надоса- .

80 «+ 1 С на 15 + +1 мин, после чего дочнуюжидкость сливают. К осадкудобавляпробы колориметрируют при 630 нм против ют 10 мл дистиллированной воды, холостой пробы. Содержание авермектинов охлажденной до температуры 4 С, Осадок находят согласно измеренной оптической суспендируютивыдерживаютпритемпераплотности по калибровочному графику в 55 туре 4 С в течение 5 мин. Суспензию центмкг/мл, который строят с помощью ивер- рифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мектина фирмы "Мерк" в концентрации 2- мин, Надосадочнуюжидкостьотбрасывают, 20 мкг/мл. Содержание авермектинов а к промытому осадку добавляют10 мл 96% составляет 0,94 мкг/мл. Следовательно, ис- этанола. Осадок суспендируют и выдержи1806351

Формула изобретения

Сравнительные данные определения содержания авермектинов в чистых препаратах и в авермектинсодержащих субстанциях.

Источник авермек- Исходная навеска, . тинов мг

Содержание авермектинов, мг определенное по способ

Пример

П ототип

П е лагаемый.10,0 + 2,0

Ивермектин фирмы

"Мерк"

9,8

9,6

9,6

9,6 . 9,6

96,0

9,6 . 9,6

80,0

3

4 .5

7

8 и и

9,4

9,8

9,6

94,0

9,3

9,3

85,0

II u и II и и

N II и н

100 0 ч- 20 О

10,0 2, О и l0

100,0 ч 20,0

í п и п

Хроматографически очищенный авермектин серии В

Мицелий

ВКМ АС 1301

60,0 мкг/мл

68,0 + 8,0 мкг/мл

70 мкг/мл

10

75,0 "= 50 мкгlмл

N N вают при комнатной температуре в течение

20 мин при постоянном перемешивании.

Пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, К 0,2 . 0,01 мл экстракта . авермектинов добавляют 2,8 + 0 1 мл нбутанола и 2,0 0,1.мл;орцинового ре.актива, Далее поступают так, как описано в примере 1. В мицелии S.avermitllis ВКМ AC

1301 определено 60 мкг/мл авермектинов, по прототипу продуктивность BKM AC 1301 составила 70 мкг/мл.

Пример 10. Определение суммарного содержания авермектинов в культуральной жидкости S.avermitllls ВКМ АС 1301 при первичном скрининге культуры. Культуральную жидкость S;avermitills BKM АС 1301 в возрасте 168часов в количестве10 мл ot 100 моноизолятов (100 образцов) центрифугируют при 3000 об/мин. Остальные процедуры выполняют так, как описано в примере 1.

Средняя продуктивность по предлагаемому методу составила 68 «+ 8 мкг/мл про,тив 75 ." 5 мкгlмл по прототипу. Следовательно, время анализа 100 образцов по предлагаемому способу занимает 170 мин, в то время как анализ 100 образцов по способу прототипу 3075 мин. Иначе говоря, время анализа сокращается в 30 раз.

Было установлено, что проведение цветной реакции при температуре выше

85 и 1 С.атакжеменее15иболее20мин нецелесообразно, так как это влияет на точность результатов. В первом случае иэ-эа резкого испарения органических растворителей, а во втором — в силу недораэвития

5 окрашивания, если нагревание осуществляется менее 15 мин или в силу того, что интенсивность скрашивания уменьшается после достижения максимума, когда нагревание длится более 20 мин, Использование

10 температуры 75 + 1 С приводит к увеличению времени проведения цветной реакции. Фотоколориметрирование образцов при длине волны ниже 630 и выше 640 нм также нецелесообразно, так как максимум

15 поглощения света цветным комплексом наступает при указанных длинах волн.

20 . Способ определения авермектинов, включающий растворение анализируемой пробы в органическом растворителе и измерение оптической плотности, о т л и ч а юшийся тем,.что, с целью упрощения и

25 ускорения, к раствору пробы в органическом растворителе добавляют раствор орцинового реактива в н-бутаноле, нагревают в течение 15 ч- 5 мин при 80 + 5 С и измеряют оптическую плотность получен30 ного окрашенного раствора при 630-640 нм.

1806351 о о

3 4О

МКГ/равд

Составитель В.Мосин

Техред М.Моргентал Корректор А.Обручэр

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 973 . . Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5