Штамм бактерий rноdососсus еryтнrороlis, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов

 

Использование: очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Штамм Rhodococcus erythrop.olls BKM Ас-1339Д имеет следующую характеристику: клетки после 18 ч культивирования палочковидные, короткие, редко, но встречаются с боковыми ветками. Через 33 ч происходит образование кокковидных элементов из палочек. Культура крамположительна, имеет IY тип клеточной стенки, содержит галактозу, арабинозу, диаминопимелиновую кислоту. Споры не образует. Колонии на МПА и МПА + СА (1:1)окрашены в палево-розовые цвета. Форма колоний округлая, размер колоний (средний) 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, край колоний ровный, структура однородная, консистенция маслянистая , способность к эмульгированию равномерная . Рост в МПБ сопровождается помутнением среды, образованием обильного осадка. Штамп бактерий характеризуется высокими скоростью.утилизации нефти и степенью биотрансформации ее тяжелых фракций. 1 ил., 4 табл. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

° (si)s С 02 F 3/34, Е 02 В 15/04

ГОСУДАРСТВЕН ЮЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ О

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 5015475/13 (22) 06.12.91 (46) 30.03.93. Бюл. N. 12 (71) Уфимский нефтяной институт (72) Г,Г.Ягафарова, И.Н.Скворцова, А П.Зиновьев и И.P.ßãàôàðoâ (56) Авторское свидетельство СССР

N -612958, кл. С 12 N 15/09, 1978.

Патент США N 3813316, кл. С 02 F 3/34, 1974. . Авторское. свидетельство СССР

N. 1076446,кл. С 12 и 15/00, С 02 F 3/34, 1987.. ° (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ЯНОООСОССОЗ .

ЕЯУТНИОРООЗ; ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ

ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И

НЕФТЕПРОДУКТОВ (57) Использование: очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Штамм

Rhodococcus егутпгоройз ВКМ Ас-1339Д имеет следующую характеристику: клетки.Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, используемого для очистки воды и почвы от .нефти и нефтепродуктов.

Целью изобретения является получение нового штамма бактерий Rhodococcus егуйгоройз, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и степенью биотрансформэции тяжелых фракций нефти.

Предлагаемый штамм депонирован в

BKM и имеет регистрационный номер

Rhodocaccus erythropolls lIk 2 BKM АС-1399

Ы2 1805097 А1

2 после 18 ч культивирования пэлочковидные, короткие, редко, но встречаются с боковыми ветками. Через 33 ч происходит образование кокковидных элементов из палочек.

Культура крамположительна, имеет lY тип . клеточной стенки, содержит галэктозу, арабинозу, диаминопимелиновую -кислоту.

Споры не образует. Колонии на МПА и МПА

+ CA(1:1) окрашены в палево-розовые цвета.

Форма колоний округлая, размер колоний (средний) 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, край колоний ровный, структура однородная, консистенция маслянистая, способность к змульгированию рав- ц номерная. Рост в МПБ сопровождается помутнением среды, образованием обильного осадка. Ш гамп бактерий характеризуется высокими скоростью. утилизации нефти и степенью биотрансформации .ее тяжелых Я фракций. 1 ил., 4 табл. д. Штамм Rhodococeus егуФгоройз получен . путем селекции из природных образцов нефтесойержаввчх почв Крайнего Севера в . районе г. Надыма, Для селекции 1 г почвы вносили в колбу обьемом 250 мл, содержащей 99 мл стерильной воды и после даль,нейшего разведения до 10":-10 степени делали посевы на МПА, среду Чапека, CA. (3-4 и 5-6 6). После 7-15 суток культивирования наиболее типичные колонии испытывали на способность расти нэ твердой минеральной среде. Маккланга, г/л дист.:. . воды: ИайОз — 2,0; MnSO< 7Н20 —, 0,5, 1805097

Рер(304)з — 0,001, K2HP04 — 1,0, 2nS04—

0;002, агар — l0-15, содержащей в качестве единственного источника углерода жидкий парафин. Для этого в чашку Петри разливали стерильную питательную минеральную среду. После того как среда застынет стерильным пробочным сверлом делали лунку.

В лунку вносили стерильный парафин. floсев микроорганизмов производили штрихом. О пасеае.ñóäèëè после 15 суток культивирования.попоявлениям колоний по штриху. Наиболее активный штамм идентифйцировали. Щтамм хранят в лиофилиэированном виде. Штамм имеет следующую. характерыстику. Морфологические признаки: клетки после 18 часов культивирования палочковидные, короткие, редко, но. всречаются с боковыми ветками. Через 33 часа происходит образование кокковидных элементов из палочек. Культура грамположительна, имеет IY тип клеточной стенки, содержит галактозу, арабинозу, диаминопимелиновую кислоту. Споры не образует. Колонии на

МПА и МПА+ CA (1:1) окрашены в палеворозовые цвета. Форма колоний округлая, размер колоний (средний(— 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, край колоний ровный, структура однородная, консистенция маслянистая, способность к эмульгированию равномерная. Рост в МПБ сопровождается помутнением среды, образованием обильного осадка.

Физико-биологические признаки. Отношение к источникам углерода; используют галактозу, арабинозу, глицерин, иноэит, лактоэу, мальтозу, маннит, рамноэу, сорбит, сахарозу, глюкозу, лимоннокислый натрий, Не разлагает целлюлозу, крахмал.

Отношения к источникам азота: использует мочевину, аммонийный азот, нитратный азот.

Не разжижает желатину, не разлагает казеин.

Не обладает лецитиназной, тирозиназной и нитратредуктазной активностью. Не растет в присутствии 7 NaCI.

Не требует в среде присутствия. факторов роста.

Аэроб.

Растет в диапазоне температуры от 10 до40 С, оптимальная областьот25до30 С.

Растет в диапазоне рН 4-9,. оптимальная зона от 7 до 8. Штамм не патогенен для человека и животных.

Биотехническая характеристика штамма Rhodococcus erythropolis.

Изучена активность штамма при его выращивании на среде с добавлением в качестве единственного источника углерода сырой нефти или ее фракций.

Для получения посевного материала используют среду Маккланга, Среду разливают по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. в течение 30 минут. Засевают 3 бактериальной взвеси, нефть вносят стерильно в количестве 1$ вес. Выращивание осуществляют на термо10 статированной качалке: 180 об/мин, 1 30 С.

Опыты ставятся в трех повторностях.

Контролями служат: минеральная среда с культурой без нефти; минеральная среда

15 и нефть без бактерий.

По истечении двух суток в опытных колбах происходит исчезновение нефти, образуется муть, что не наблюдается в контрольных колбах.

20 О биотрансформации нефти судят электрофотометрически на приборе Ий-20-при

2923 см, предварительно экстрагируя нефть четыреххлористым углеродом.

Кроме того ежесуточно определяют ко25 личество жизнеспособных клеток методом

Коха, а также биомассу весовым методом на мембранных фильтрах. Для этого мембранные фильтры N. 1 предварительно доводят до постоянного веса. Результаты приведе30 ны в табл, 1.

Как видно из табл. 1, длительность лаг. фазы составляет менее 1 суток. Экспоненциальная фаза продолжает около 2 суток, стационарная — 3 суток, затем происходит

35 отмирание культуры. Прирост биомассы на

2 сутки составляет 0,075 г/л. Данные по биодеструкции нефти представлены в табл.

2, Как видно из табл. 2, наибольшая сте40 пень биоразложения нефти (80 — 87 ) достигается на 2-3 сутки.

Пример. В серии опытов штамм выращивали в минеральной среде с добавЛением в качестве единственного источника

45 углерода: парафин, дизельное топливо, нефть, универсин "В", содержащий тяжелые нефтяные остатки: гудрон и экстракты масляных фракций.

Минеральную среду Маккланга (состав

50 приведен выше) разливают по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Засевают из расчета

3 по объему бактериальной взвеси. В качестве единственного источника углерода

55 добавляют парафин, дизельное топливо, нефть, универсин "В" в количестве 1 ° 2, 3, 4, 5$ вес.

Условия выращивания описаны выше.

О биораэложении нефти, универсина, дизельного топлива судят путем количест1805097 венного анализа методом экстракции этих Посевной материал выращивают 8 жидсоединений четыреххлористым углеродом с кой минеральной среде. Маккланга. В качепоследующим измерением оптической стае единственного источника углерода плотности экстракта при 2923 см íà спек- добавляют жидкий йарафин в количестве трофотометрв MR-20, а парафина при 1460 5 37ь вес. Для этого среду разливают по 50 мл см . в качалочные колбы объемом 250 мл и стеНа чертеже представлены результаты рилизуют при 1 атм. в течение 30 мин, Параиэучения зависимости. биодеструкции па- фин стерилизуют отдельно и вносят перед рафина, дизельного топлива, нефти и уни- посевом. Микроорганизмы вносят путем версина "В" в воде через 40 часов (1 —. 10 смыва из косячков. Выращивание осущестпарафин, 2 — дизельное топливо, 3 — нефть, вляют на термостатированной качалке: 180 4- универсин "В"), .. об/мин, t -30 С, Посевной материал выраИз приведенных данных видно, что щивают втечение 1 суток. 2л сточной воды, предлагаемый штамм Rhodococcus содержащей t00 мг/л нефти, наливают в

erythropofis ЬЬ 2 ВКМ АС 1339Д способен 15 лабораторный аэротенк объемом 5 л. Вноиспользовать не только легкие фракции c5IT посевной материал в количестве 5 от нефти, такие как парафин, но и дизельное . объема. При помощи 5 раствора йаНСОз топливо и более тяжелые фракции нефти, доводят рН до 7; В аэротенк при помощи такие как парафин, но идизельноетопливо компрессора продувается воздух в количеи более тяжелые фракции нефти, как уни- 20 стве 15-20л в минуту. О биоочистке сточной версин "В", т.е. разлагать широкий спектр воды от нефти судят спектрофотометричеуглеводородов. Причем штамм не теряет ски на приборе Ий-20 при 2923 см, предсвою окислительную активность при содер- варительно экстрагируя нефть жании парафина, дизельного топлива, неф-. четыреххлористым углеродом. .ти и универсина при 5 вес. Максимальная 25 Из табл. 4 видно, что предлагаемая кульбиодеструкция наблюдается при содержа- тураййобососсизегуФгороИзспособнаочинии исследуемых нефтепродуктов в количе- щать и реальные стоки, при этом за 24 часа стве 1 вес. и составляет для парафина — . содержание нефти. уменьшается с 100 мг!л

85, дизельного топлива — 80, нефти — до 10 мг/л.

78, универсина -45 (.. 30 Пример. Очистка почвы от нефти и

Проводили.-также изучение. активности нефтепродуктов. штамма при разложении нефти 8 почве. Для Отбираются нефтезагрязненные пробы . этого в пробирку обьемом 50 мл вносят пе- почвы у буровой скважины. Содержание сок в количестве 25 г., стерилизуют в авто- . нефти и нефтепродуктов в почве составляло клаве при температуре 120 С в течение 30 35 3 вес. Отобранная почва насыпается вэксмин. Вносят минеральное удобрение диам- икатор. Для сохранения влажности на дно мофос из расчета 0.03 вес и.нефть в коли- . эксикатора ставят стакан с водой. Для возчестве 0,41 r на 25 почвы. Посевной духообменас крышкиэксикатора отводится материал вносят из расчета 3 Jf по объему стеклянная трубка,-которая закрыта ватным бактериальной взвеси. Контролем служат 40. фильтром. пробирки без бактерий. Микроорганизмы - . -Для очистки почвы готовят водную культивируются при комнатной температу- смесь, включающую штамм Rhodococcus ре. Время культивирования 40 суток. Коли- erythropolis с плотностью 10 -10 клеток в 1 чественный учет биоразложения нефти мл и диаммофос из расчета 0,03 . Микроведут спектрофотометрически на приборе 45 организмы выращивают в жидкой мине-1

MR-.20 при 2923 см; предварительно экс- ральной среде Маккланга с парафином. трагируя нефть четыреххлористым углеро- Приготовленную водную смесь равномерно дом. В табл. 3 приведены результаты распределяютнанефтезагрязненнуюпочву исследований. из расчета 1 л на 1 м . По истечении 40 и 60

50 суток оценивают количество оставшейся .

Таким образом предлагаемый штамм нефтиметодомспектрофотометрии.

Rhodococcus erythropolis М 2 ВКМ АС1339Д остается активным и в почве. Биораз- В результате исследований выявлено ложение нефти . через 40 суток количество нефти и нефтепродуктов после культивированиясоставляет76, Вконтро- 55 40 суток культивирования уменьшается с ле естественная убыль нефти оставляет0,01 . 3 до 1, а после 60 суток до 0,21 ге

Пример. Очистка стоков Уфимского Таким образом, предлагаемый штамм нефтеперерабатывающего завода им. XXII Rhodococcus erythropolls способен очищать съезда КПСС. . реальную нефтезагрязненную почву.

1805097

Таблица 1

Реэультаты роста микроорганизмов в среде с нефтью

Таблица2

Влияние длительности культивирования на степень биоразложения нефти

Формуле иэобретения

Штамм бэктерий Rhodococcus егуФгороИэ ВКМ Ас - 1339Д; используемый для очистки воДы и почвы от нефти и нефтепродуктов.

1805097

ТаблицаЗ

Таблица4

Результаты очистки реальных стоков

2 3

Конценщ рация, %

Результаты биоразложения нефти в почве