Способ очистки крови от антител к нативной днк

 

Изобретение относится к медицине, в частности к экстракорпоральным методам удаления специфических антител из крови и других биологических жидкостей, и может использоваться в ревматологии и биотехнологии. Цель изобретения - повышение степени очистки крови от антител. Кровь пропускают через сорбент с иммобилизованной нативной ДНК, причем в качестве сорбента используют железосодержащие полиакриламидные гранулы с включенной в трехмерную решетку геля методом эмульсионной полимеризации нативной ДНК. По сравнению с прототипом предлагаемый способ обеспечивает в 10 раз большее снижение титра антител и истощает в 7 раз большее количество сыворотки. При этом способ отличается высокой эффективностью, специфичностью и малой травматичностью. 4 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к экстракорпоральным методам извлечения специфических антител из крови и других биологических жидкостей, и может применяться в ревматологии и биотехнологии. Цель изобретения повышение степени очистки крови. Способ осуществляют следующим образом. Через иммуносорбент пропускают кровь, причем в качестве иммуносорбента используют полиакриламидные гранулы с магнитными свойствами, полученные методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота, с иммобилизованной в трехмерную решетку геля нативной ДНК. П р и м е р 1. В 2 мл физиологического раствора растворяют соответственно 100 мг и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида, а также 32 мг нативной ДНК ("Реанал", Венгрия). В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подают под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносят 1 мл забуференного физиологического раствора (рН 7,4) с 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония, через 1-2 мин добавляют 2 мл раствора, содержащего мономеры акриламида, метиленбисакриламида, ДНК и 20 мкл N'N'N'N'-тетраметилэтилендиамина (ТЭМЭД). После завершения полимеризации в течение 10-15 мин гранулы отмывают ацетоном и забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) с детергентом Твин-20 (0,05% ) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Гранулы имели стандартную сферическую форму с размером частиц геля 10-100 мкм (средний диаметр гранул 556,2 мкм). Оптимальная концентрация ДНК для включения в гранулы установлена экспериментально по сорбционной емкости сорбентов, полученных при использовании разных концентраций ДНК. Установлено, что максимальная емкость сорбента достигается при концентрации ДНК 16 мг/мл. Данная концентрация является оптимальной и использовалась во всех дальнейших экспериментах. Нативность ДНК проверялась спектрофотометрически по наличию гиперхромного эффекта на длине волны 260 мм после прогревания используемой ДНК в течение 30 мин при 85^оС. Экстинкция образца до тепловой денатурации составляла 0,52, после нее 0,77. Полученные значения соответствуют высокой концентрации нативной ДНК в исследуемой пробе. Под микроскопом (объектив 8, окуляр 10) подсчитывали количество гранул в 0,05 мл 5% -ной взвеси. Далее определяли объем гранул, имеющих площадь поверхности 70 см² (так как в прототипе использовался иммуносорбент такой же площади). Средний диаметр гранул определен экспериментально и равен 556,2 мкм. Для упрощения сравнения предлагаемого способа с прототипом полученный объем гранул (10,8 мл) использовался во всех дальнейших экспериментах. Затем в колонку вносят 10,8 мл гранул и перфузируют через нее 20 мл сыворотки, содержащей антитела к нативной ДНК (37^оС). Затем сорбент отмывают от несвязавшихся белков забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) и приводят элюцию 0,1 М глицин-НСl буфером (рН 2,8) с последующим иммунохимическим анализом. В сыворотке определяли титры антител к нативной ДНК до и после сорбции методом непрямой иммунофлюоресценции на иммобилизованных препаратах ДНК с использованием фотометрической приставки ФМЭЛ-1А, а также концентрацию белка в элюате по Лоури. По приведенной методике проведена сорбция антител из сывороток крови 10 больных системной красной волчанкой (СКВ). В качестве контроля использовали 10 сывороток практически здоровых лиц. Полученные результаты представлены в табл. 1. Титр антител до сорбции был достоверно выше у больных, чем у здоровых лиц (р < <0,001). После сорбции происходило снижение титров до уровня доноров (р < 0,05). Емкость иммуносорбента составила 3,290,06 мг/г сорбента. По сравнению с прототипом предложенный сорбент обеспечивает более выраженное снижение титра специфических антител к нативной ДНК (в 10 раз) и истощает большее количество сыворотки (в 7 раз). П р и м е р 2. В колонку вносят 10,8 мл гранул и перфузируют через нее 20 мл нативной гепаринизированной крови, полученной от больных системной красной волчанкой и содержащей антитела к нативной ДНК, со скоростью 10 мл/ч. Далее сорбент отмывают от несвязавшихся белков забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) и проводят элюцию 0,1 М буфером глицин-НСl (рН 2,8) два раза по 10 мин. Определяли титры антител к нативной ДНК до и после сорбции методом непрямой иммунофлюоресценции на иммобилизованных препаратах ДНК с использованием фотометрической приставки ФМЭЛ-1А, концентрацию белка в элюате по Лоури, содержание форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) до и после иммуносорбционной процедуры. По данной методике проведена сорбция антител из крови 10 больных. В качестве контроля использовали 10 сывороток здоровых лиц. Результаты по сорбции антител из крови приведены в табл. 2, по изменению содержания форменных элементов крови в табл. 3. Из результатов следует, что сорбция вызывает снижение титра антител до уровня доноров (р < 0,05), при этом содержание форменных элементов крови достоверно не меняется. Емкость сорбента составила 3,3 0,06 мг/г сорбента. После сорбции гранулы регенерируют 0,1 М буфером глицин-НСl (рН 2,8) или 3 М раствором роданида калия (КСNS). После первой регенерации потеря активности составила 10% при последующей регенерации до 10 раз потери активности не происходило. Для контроля специфичности сорбента 1 г гранул перемешивали с 5 мл сыворотки крови донора на магнитной мешалке. С интервалом 15 мин в течение 1 ч в ней определяли концентрацию белка по Лоури, иммуноглобулинов классов G, A, M, по Манчини. Полученные результаты представлены в табл. 4. Полученные данные готовят о низкой неспецифической емкости сорбента. Таким образом, предлагаемый сорбент инертен, имеет низкую неспецифическую сорбционную емкость, обладает эластичной поверхностью, сводящей к минимуму повреждение форменных элементов крови. Включение магнитного материала упрощает манипуляции с гранулами, а также позволяет поддерживать их во взвешенном состоянии в процессе сорбции, что снижает травмирующее действие сорбента на кровь и повышает площадь соприкосновения с жидкостями. Иммобилизация антигена методом эмульсионной полимеризации позволяет регенерировать и многократно использовать его без снижения сорбционной массы. Предлагаемый сорбент может использоваться в сорбционных методах извлечения антител из биологических жидкостей. Его высокая эффективность, специфичность и малая травматичность позволят расширить показания к проведению процедуры и улучшить эффект от нее, что будет способствовать улучшению прогноза, снижению инвалидности и увеличению средней продолжительности жизни при СКВ. Применение метода позволит получить экономический эффект за счет сокращения сроков госпитализации больных и возможности повторного использования гранул.

Формула изобретения

СПОСОБ ОЧИСТКИ КРОВИ ОТ АНТИТЕЛ К НАТИВНОЙ ДНК, включающий пропускание крови через сорбент с иммобилизованной нативной ДНК с последующим сбором очищенной крови, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки крови от антител, в качестве сорбента используют железосодержащие полиакриламидные гранулы с иммобилизированной в их структуре нативной ДНК.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2