Способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения

 

Использование: область биохимической генетики, способы определения изоферментов - дигедрогеназ в листьях персикового растения. Сущность изобретения: способ включает нанесение препарата ферментов на 20% полиакриламидный гель и использование в качестве буферных систем составов - Трис - 215 г, ЕДТА - 18 г, НзВОз - 110 г, НаО до 2,5 л с рН 8,3, разведенных водой в соотношении 1:7 для электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера. В качестве красящих растворов используют Трис HCI буфер с рН 8,5 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н20, НАД -2 мг, МТТ - 2 мг, ФМС - 3 мг плюс 5 мл спирта для идентификации алкогольдегидрогеназы. Для идентификации лактатдегидрогеназы используют состав: фосфатный буфер 0,5 М с рН 7,4 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н20, лактат натрия 550 мл, ФМС - 2 мг, МТТ- 15мг и 15 мг. 2 ил. Недостатком указанного способа является то, что он позволяет определять сравнительно малую часть изоферментных систем в растении персика. Известен способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения (прототип ), состоящий из приготовления частично очищенного препарата ферментов , нанесения его на гель, проведения электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, VJ 00 00 о о ю (л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 0 1/32

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4923273/13 (22) 01,04,91 (46) 15.01,93. Бюл. М 2 (71) Грузинский научно-исследовательский институт садоводства, виноградарства и виноделия и Всесоюзное научно-производственное объединение по чаю. субтропическим культурам и чайной промышленности (72) Д,Н.Маградзе, И.Г,Керкадзе, В,P.Êaaëèашвили и Л.К.Вашакидзе (73) Научно-исследовательский институт садоводства, виноградарства и виноделия

Грузинской республики и Всесоюзное научно-производственное объединение по чэю, субтропическим культурам и чайной промышленности (56) S.Arulsekar, D.Е,Parfitt; W.Berres, P.Е.Hansche. Genetics of malat dehidrogenas

isozymes in the peach. The J. of Heredidy. 77, р. 49 — 51, 1986.

R.Е.Durham, G.À.Moore and

W.Â.Sharman. — Isozyme Banding patterns

and their usefulness as genetic markers in

peache. J,Amer. $ос, Hort. Sci. 112 (6), 1987, р. 1013 — 1018.

Изобретение относится к области биохимической генетики, а именно к способам определения изоферментов, в частности дегидрогеназ в листьях персикового растения.

Известен способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения, включаю ций электрофорез белковых растворов из тканей, с последующей гистохимической окраской для выявления зон, обладающих ферментативной активностью.. Ж 1788969 А 3 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗ В ЛИСТЬЯХ ПЕРСИКОВОГО РАСТЕНИЯ (57) Использование: область биохимической генетики, способы определения изоферментов — дигедрогеназ в листьях персиковогб " растения. Сущность изобретения: способ включает нанесение препарата ферментов на 20ь полиакриламидный гель и использование в качестве буферных систем составов — Трис — 215 г, ЕДТА — 18 г, НэВОз — 110 r, Н20 до 2,5 л с рН 8,3, разведенных водой в соотношении 1:7 для электродного буфера и

1:3 для гелевого буфера. В качестве красящих растворов используют Трис HCI буфер с рН 8,5 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н20, НАД вЂ” 2 мг, МТТ вЂ” 2 мг, ФМС вЂ” 3 мг плюс 5 мл спирта для идентификации алкогольдегидрогеназы. Для идентификации лактатдегидрогеназы используют состав: фосфатный буфер 0,5 М с рН 7,4 в количестве 7 мл плюс

28 мл Н20, лактат натрия 550 мл, ФМС вЂ” 2 мг, MTT — 15 мг и НАД вЂ” 15 мг, 2 ил, Недостатком указанного способа является то. что он позволяет определять сравнительно малую часть иэоферментных систем в растении персика.

Известен способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения (прототип), состоящий из приготовления частично очищенного препарата ферментов, нанесения его на гель, проведения электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, 1788969 субстрат и систему тетразолюма с присутствием феназин-метасульфата и идентификацию ферментов по окрашенным полосам на геле.

Недостатком данного способа является то, что он не дает возможность определения ал когол ьдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, Цель изобретения — расширение диапазона определяемых изоферментов в персиковом растении.

Поставленная цель достигается тем, что частично очищенный препарат ферментов наносят на полиакриламидный гель (20 ).

В качестве буферных систем применяют маточную буферную систему в составе:

Трис — 215 г, ЕДТА — 18 г, НзВОз — 110 г, Н20 до 2,5 л при рН 8,3, разводимый в воде 1:7 для электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера.

При этом для идентификации алкогольдегидрогеназы (АДГ) (Е.С,1.1,1,1) в качестве красящего раствора используют; Трис HCI буфер рН 8,5 7 мл + 28 мл Н О, НАД вЂ” 25 мл, МТТ вЂ” 25 мл, ФМС 3 мг+ 5 мл спирта.

Для идентификации лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Е.С,1,1.1.27) применяют фосфатный буфер в составе 0,5 м рН 7,4 — 7 мл +

28 мл Н О, лактат натрия 550 мл, ФМС вЂ” 2 мг, МТТ вЂ” 15 мг, НАД вЂ” 15 мг.

Заявленный способ отличается от прототипа составом буферных систем и содержанием красящих растворов, что дает возможность дополнительно к известным дегидрогеназам прибавить еще два изофермента АДГ (ЕС 1.1.1.1) и ЛДГ (ЕС 1,1,1.27).

Э ф ф е к т достигается за счет того, что обнаружение алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы позволяет расширить генетическую информацию о персиковом растении и облегчает селекционную работу с этой культурой.

На фиг,1 изображены электрофоретические спектры АДГ из листьев персика, сорта: "Картули сапоби (1; 2) и "Беставашвили (3; 4); на фиг.2 — электрофоретические спектры ЛДГ из листьев персика, сорта: "Картули сапоби" (1; 2) и "Беставашвили" (3; 4).

Способ осуществляется следующим образом: В качестве исходного материала используютт хорошо развитые, зеленые листья однолетнего побега 5-го, 6-го порядка, Образцы для исследования используют в 1 — 10 дневный срОк; храня их при температуре+4, +5 С.

Для гомогенизации используют раствор в составе; 36 г сахарозы, 106 r аскорбиновой к-ты, 94 г цистейн гидрохлорида, до 100 мг гелевого буфера, Раствор фильтруют. При растирании образцов добавляют битое стекло, Материал центрифугируют s течении 20-30 мин. При скорости вращения

20000 об/мин.

5 Частично очищенные препараты дегидрогеназ листьев персика наносят на полиакриламидный гель (20 ), проводят электрофорез при постоянном электрическом токе 220 Вольт при температуре +4, 10 +9 С, В качестве буферных систем применяют маточную буферную систему в составе: Трис — 215 r, ЕДТА — 18 г, НзВОз — 110 г, НгО до

2,5 л при рН 8,3, разводимый в воде 1:7 для

15 электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера.

В качестве красителей используют 3 (4,5 — диметилтиазолил 1 — 2) 2,5 — дефенил — тетразолий — бромид (МТТ) в присутствии фе20 назинметасульфата (cDМС), Пример 1. Определение алкогольдегидрогеназы (Е,С.1.1,1 1). Суммарный препарат на геле помещают в кювету с раствором, содержащим: Три с H C I буфер

25 рН 8,5 — 7 мл + 28 мл HzO

НАД+ ... 25 мг

МТТ .„25 мг

ФМС ... 3 мг+ 5 мл спирт.

Выдерживают в термостате при 37 С в

30 течение 12 ч. Окрашенный препарат фиксируют в 10 -ной уксусной кислоте, Пример 2. Определение лактатдегидрогеназы (ЕС.1.1.1.27). Суммарный препарат на геле помещают s кювету с раствором, 35 содержащим:

Фосфатный буфер 0,5 м рН 7,4-7 мл+ 28 мл Н20

Лактат натрия „, 550 мг

ФМС...2мг

40 МТТ ... 15 мг

НАД ... 15 мг.

Время проявления 1 час, при 37 С в термостате, фиксируют в 10 уксусной кислоте, 45 Результаты опыта. Объектом исследования служили Грузинские сорта персика

"Картули сапоби" и "Беставашвили". Для проведения анализа на участке (в Горийском районе) с каждого сорта выбирали по

50 35 — 40 деревьев, Опыты проводились летом (июль) 1989 года и осенью (октябрь) 1990 года.

На фиг. I и 2 приведены полученные электрофоретические спектры АДГ и ЛДГ.

55 Алкогольдегидрогеназа (ЕС 1,1,1,1) в листьях обоих Грузинских сортов персика представлена тремя компонентами: Rf 0,12;

0,23 и 0,40 (см. фиг.1). Средние миграционные дистанции от начальной нулевой линии составляли 1,2; 2 3; 4,0 см соответственно

1788969

0.0

0.0

О.I

0.2 в о. г

В 0.23

О,I

0.2

0.3

R О.20

0.3

0.0

Я 0.33 в3 о .но а3 о.аа

R) О. О

О.М

0.5

0.5

0.6

0,6

0.7

0.7

2 3 4

Фиг.j

Фиг.2

Составитель Д.Маградзе

Техред М.Моргентал Корректор О.Юрковецкая

Редактор

Заказ 83 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 для каждой Rf. По числу и подвижности компонентов эти сорта между собой не отличались, Однако активность фермента у сорта

"Беставашвили" по компоненту Rf 0,12 была выше, чем у сорта "Картули сапоби". 5

Лактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.27) в листьях сорта "Картули сапоби" представлена двумя компонентами (см. фиг.2) Rf 0,20 и

0,40. Средние миграционные дистанции от начальной нулевой линии составляли 2,0 и 10

4,0 см соответственно. В листьях сорта

"Беставашвили" ЛДГ представлена тремя компонентами — Rf 0,20; 0,33 и 0,44. Средняя миграционная дистанция от начальной линии 2,0; 3,3 и 4,4 см соответственно для 15 каждой Rf.

При изучении индивидуальной изменчивости обнаружено, что различные деревья одного сорта в основном не 20 отличаются по компонентному составу по

АДГ и ЛДГ. Электрофоретические спектры были стабильными в течение всего периода вегетации. Осенью активность ферментов уменьшалэсь. 25

Предложенный способ позволяет определить дополнительно два изофермента, в частности АДГ и ЛДГ, чем достигается расширение диапазона генетической информации определяемых изоферментов, что имеет 30 большое значение для генетической и селекционной работы с культурой персика.

Формула изоб ретения

Способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения, включающий приготовление частично очищенного препарата ферментов из листьев, нанесение его на гель, проведение электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, субстрат и систему тетразолюма с присутствием феназинметасульфата и идентификацию ферментов по окрашенным полосам на геле, о т л и ч а юшийся тем, что нанесение препарата осуществляют на 20%-ный полиакриламидный гель, а в качестве буферных систем используют маточный буфер в составе Трис—

215 г, ЕДТА — 18 г, НзВОз — 110 г, Н20 до 2,5 л с рН 8,3, разводимый водой в соотношении 1:7 для электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера, при этом в качестве красящих растворов используют Трис HCI буфер с рН 8,5 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н20, НАД вЂ” 2 мг, МТТ вЂ” 2 мг, ФМС вЂ” 3 мг+ 5 мл спирта для идентификации алкогольдегидрогеназы и фосфатный буфер 0,5 М с рН 7,4 в количестве 7 мл + 28 мл НгО, лактат натрия

550 мл, ФМС вЂ” 2 мг, МТТ вЂ” 15 мг, НАД вЂ” 15 мг для идентификации лактатдегидрогеназы.