Поддерживающая питательная среда для культур клеток при культивировании вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей

 

Изобретение относится к вирусологии и касается питательных сред для поддержания культур клеток при культивировании РНК-соде ржа щих почкующихся вирусов, в частности вируса венесуэльско го энцефаломиелита лощадей. Цель изобретения - повышение термоустойчивости культивируемого вируса. Для этого используется поддерживающая питательная среда, содержащая стандартную питательную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический стабилизатор липидной природы. В качестве стабилизатора используют холестерин из мозга крупного рогатого скота в липидорастворителе при следующем соотношении компонентов, мг/л: холестерин 5-25; липидорастворитель 0,5-1; стандартная питательная среда с 2%- ной сывороткой КРС до 1 л. В качестве липидорастворителя используют смесь хлороформа с твином 85 в объемном соотношении 10:1. 4 ил., 2 табл. сл С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st>s С 12 N 5/00,5/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (Р.,О v

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ с !

Ы

6ä

) Ь

1 0

1)» (21) 4749357/13 (22) 12.07.89 (46) 30,03.92. Бюл. N. 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) В,Л.Поздеев и В,М,Чермашенцев (53) 576.8.094.29:576,858 (088.8) (56) Simpson R;W. Hauser R,Å. Influence of

lipids on the Viral Phenotype,— Virology.

1966.— v, 30.— р. 684 — 697.

Методы /Под ред. Б.Мейхи, М.: Мир, 1988, с. 107-108. (54) ПОДДЕРЖИВАЮЩАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ

СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ (57) Изобретение относится к вирусологии и касается питательных сред для поддержаИзобретение относится к вирусологии и касается питательных сред для поддержания культур клеток при культивировании, Известна поддерживающая питательная среда, включающая стандартную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический стабилизатор липидной природы.

Целью является повышение термоустойчивости культивируемого вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей за счет увеличения концентрации холестерина в среде культивирования.

Цель достигается тем, что поддерживающая питательная среда для культур клеток при культивировании вируса венесуэльского энцефаломиелита лощадей включает... Ы 1723119 А1 ния культур клеток при культивировании

РНК-содержащих почкующихся вирусов, в частности вируса венесуэльского энцефаломиелита лощадей. Цель изобретения— повышение термоустойчивости культивируемого вируса. Для этого используется поддерживающая питательная среда, содержащая стандартную питательную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический стабилизатор липидной природы. B качестве стабилизатора используют холестерин из мозга крупного рогатого скота в липидорастворителе при следующем соотношении компонентов, мг/л: холестерин 5 — 25; липидорастворитель

0,5-1; стандартная питательная среда с 2%ной сывороткой КРС до 1 л. В качестве липидорастворителя используют смесь хлороформа с таином 85 в объемном соотношении 10;1. 4 ил., 2 табл, стандартную питательную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический стабилизатор липидной природы. В качестве стабилизатора используют холестерин из мозга крупного рогатого скота в липидорастворителе при следующем соотношении компонентов;

Холестерин 5-25 мг/л

Липидорастворитель 0,5 — 1 мл/л

Стандартная питательная среда с 2%-ной сывороткой КРС До1л

В качестве липидорастворителя используют смесь хлороформа с твином 85 в объемном соотношении 10:1.

Питательная среда готовится на основе стандартной питательной среды Игла МЕМ

1723119

Hepes с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота. В среду добавляют биологический стабилизатор липидной природы. В качестве стабилизатора используют холестерин, полученный из мозга KPC в концентрации 5-25 мг/л. Холестерин вводят в среду культивирования в липидорастворителе в концентрации (0,5 — 1)мл/л. Липидорастворитель содержит хлороформ и твин-85 в объемном соотношении 10:1. Конечное содержание растворителя в среде не превышает 0,1 об.%. Полученную смесь встряхивают, после чего среда готова к применению. Двухсуточные монослои перевиваемых клеток почки зеленой мартышки

vего, выращенные во флаконах на базовой среде с добавлением 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота, заражают 0,1 мл вируссодержащей жидкости на основе штамма ТС-83 вируса венесуэльского энцефаломиелита из расчета 1 — 10 60E/кл. После адсорбции (40 мин) монослои заливают предлагаемой в заявке поддерживающей питательной средой, После инкубации при

37 С в течение 3 сут образцы с полученной

ВСС выдерживают при 37 С 5 сут с последующим тестированием инфекционности на первичной культуре клеток ФЭК под твердым агаровым покрытием.

Составы поддерживающих питательных сред приведены в табл. 1.

Контрольный состав содержит среду Игла МЕМ Hepes с 2%-ной сывороткой КРС 1 л, Тестирование инфекционного штамма

ТС-83 вируса осуществляют для каждого состава питательных сред. После анализа полученных данных получают динамику инактивации штамма ТС-83 вируса в суспензии (фиг,1 — 4).

Константы скоростей инактивации вируса при 37 С приведены в табл. 2.

Для расчета констант скоростей инактивации использовалась модель вида

С = Со ехр(— K > t), (1) где Ки — константа скорости гибели вируса;

Со и С вЂ” соответственно исходная и текущая концентрации вирусов; с — время экспозиции.

В соответствии с (1) строились линейные регрессии для функции

T= lg С

Т=а+ Ьс (2)

Тогда коэффициент инактивации

К.. = -Ь . Ig 10 (3)

Для определения коэффициентов модели (1) используют взвешенный метод наименьших квадратов.

Исследования показывают, что концентрация холестерина в предложенной среде

50 до 5 мг/л определяется присутствием сыворотки КРС. Увеличение концентрации холестерина до 50 мг/л (фиг.4) приводит к отрицательному эффекту при хранении вируса в суспензии по сравнению с контролем. Из фиг,1 — 3 следует, что холестерин в концентрации 5 — 25 мг/л оказывает стабилизирующее действие на сохранение инфекционности вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в суспензии при

37 С. При исходно равных значениях титра инфекционности для всех образцов, исключая образец, содержащий 50 мг/л холестерина, в котором исходный титр ниже, наблюдают более медленную инактивацию вируса. Разница между титрами опытных и контрольных образцов составляет к концу 5 сут хранения 0,5 — 1,5 Ig БОЕ/мл. Концентрация холестерина 50 мг/л среды приводит к ускоренной инактивации вируса (фиг.4).

Константы скоростей инактивации для концентраций холестерина 5 — 25 мг/л статистически значимо отличаются от контроля и имеют более низкие значения, а для концентрации 50 мгlл превышают или неотличимы от контрольных образцов, где концентрация холестерина менее 5 мг/л или отсутствует вообще. Диапазон концентраций липидорастворителя в питательной среде составляет

0,5 — 1 мл/л. При концентрации растворителя более 1 мл/л на клетки культуральной среды оказывается токсическое воздействие, Концентрация растворителя менее 0,5 мл/л ограничена возможностью растворения в нем холестерина, Соотношение хлороформа с твином 85 (10:1) в растворителе подобрано также из соображения наименьшего токсического воздействия на клетки культуральной среды и оптимальности растворения холестерина и последующего его перевода в водную фазу при смешении с питательной средой.

Формула изобретения

Поддерживающая питательная среда для культур клеток при культивировании вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включающая стандартную питательную среду с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота и биологический стабилизатор липидной природы, о т л и ч аю щ а я с я тем, что, с целью повышения термоустойчивости культивируемого вируса, в качестве стабилизатора используют холестерин из мозга крупного рогатого скота в липидорастворителе, представляющем смесь хлороформа с твином 85 в объемном соотношении 10:1 при соотношении компонентов

Холестерин 5-25 мг

Липидорастворитель 0,5 — 1 мл

1723119

15

25

Стандартная питательная среда с 2 -ной сывороткой крупного рогатого скота

До 1л

Таблица 1

Таблица 2

1723119

Составитель В.Поздеев

Техред М.Моргентал Корректор В.Гирняк

Редактор Н.Горват

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1042 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 .