Способ определения величины синтеза днк в лейкоцитах периферической крови

 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано в клинической биологии при определении влияния лекарственных средств на синтез ДНК. Цель изобретения - повышение точности - достигается за счет определения включения Н3-тимидина в двух образцах, в первом Н3- тимидин добавляют до инкубации, а во второй - после инкубации.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/60

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4719989/14 (22) 14,06.89 (46) 07.03.92. Бюл. ¹ 9 (71) Тюменский государственный медицинский институт (72) Л. Е. Немировский, А. Г. Гиновкер, В.К.Васильев,Э.А,Кашуба и В,А. Дроздов (53) 612.015(088.8) (56) Ехр. СеП Res, 1974, V. 88 ¹ 1, р. 47 — 55.

Trosko I. E„Jager!, О.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для оценки синтеза ДНК при воздействии лекарственных средств.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

20 мкл цельной крови, взятой из пальца микропипеткой,ге пари низи рован ной раствором гепарина в растворе Хэнкса (100 Е/мл), переносят в конические пробирки, добавляют Н -тимидин в растворе Хэнкса в объеме

2 мкл до конечной концентрации 10 мкКи/мл, после чего к первым образцам сразу добавляют 6 мкл 2%-ного раствора сапонина в растворе Хэнкса, а к вторым образцам сапонин добавляют после двухчасовой инкубации при 37 С, Вызванный сапонином геMîë 13 развивается в течение нескольких секунд, после чего к гемолизату добавляют 500 мкл холодного раствора, содержащего 0,1 М ЭДТА; 0,15 M NaCI, 1%ный пирофосфат натрия, Ядерный материал,,5U(1718122 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕЛИЧИНЫ

СИНТЕЗА ДНК В ЛЕЙКОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано в клинической биологии при определении влияния лекарственных средств на синтез ДНК.

Цель изобретения — повышение точности— достигается за счет определения включения

Н -тимидина в двух образцах, в первом Нтимидин добавляют до инкубации, а во второй — после инкубации. осаждают центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин. Осадок суспендируют в 100 мкл 1 н, NaCI. Солюбизированный хроматин прогревают в течение 15 мин на кипящей водяной бане для депротеинизации ДНК.

Денатурировавший белок осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 10000 д. Псоле этого к супернатанту добавляют 50 мкл холодного 30%-ного раствора ТХУ и оставляют на 30 мин при 0 С для выпадения осадка, содержащего нуклеиновые кислоты, который собирают на стеклянные фильтры фирмы Ватман GF/C. Осадок на фильтрах три раза промывают 2%-ным HCIO4, порциями по 2 мл, 96%-ным этанолом, подсушивают и переносят в 100 мкл 0,5 н.NaOH для гидролиза PHK в течение 1 — 12 ч без заметной разницы. Гидролизат отбирают под вакуумом, добавляют к нему 100 мкл холодного 30%-ного раствора ТХУ и осадок, содержащий ДНК, собирают и промывают на фильтрах, как описано выше. Подсушенные фильтры просчитывают в 5 мл толуолового сцинтиллятора. Величину синтеза

1718122 определяют как разницу между первым показателем включения Н -тимидина в ДНК и з вторым показателем, 15

25

35

45

50.

Составитель С.Рыбалкин

Техред М,Моргентал Корректор Л.Патай

Редактор Л.Волкова

Заказ 877 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

Способ определения величины синтеза

ДНК в лейкоцитах периферической крови путем введения образца крови в инкубационную среду, добавления Н -тимидина, проз ведения щелочного гидролиза хроматина и определения радиоактивности в кислотнонерастворимом осадке, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения точности способа, исследуют два образца крови, ко5 торые инкубируют не менее 2 ч при 37 С, причем в первый образец Н -тимидин доз бавляют до инкубации, во второй — после инкубации, а величину синтеза определяют как разницу между первым и вторым пока10 зателем включения Н -тимидина в ДНК.