Способ получения литиевых солей бромсодержащих 8-замещенных (имидазо/2,1-i/пуринил-3)- @ -д-рибофуранозил-5 @ -фосфатов

 

Изобретение касается нуклеотидов, в частности получения трилитиевой соли {8- [4-(бромацетил)фенил]имидазо[2,1 -1]пурин ил-3}-)5-0-рибофуранозил-5 -трифосфата или литиевой соли {8-[4-(б'ромметил)-фенил]имидазо[2,1 -{]пуранил-3}-О-рибофуранозид-З ,5 -циклофосфата, которые могут быть использованы в качестве флуоресцентных аналогов адениловых нуклеотидов дляселективной модификации активных (или регуляторных) центров соответствующих ферментов, имеющих в районе связывания зкзо-МН2-группы молекулы субстрата определенную нуклеофильную группу, например - SH, а также в биологии для регуляции уровня адениловых нуклеотидов в клетках различных тканей. Цель - создание новых полезных веществ указанного класса. Синтез ведут реакцией Na-солей аденозин-3 .5'- циклофосфата или №-солей аденозин-5'-диили трифосфата с 1,1-

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 07 Н 19/23

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ. КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4712497/04 (22) 29.06.89 (46) 23.02.92. Бюл. й. 7 (71) МГУ . М. В. Ломоносова (72) Ю. B. Хропов и С. B. Кулагин (53) 547.455,07(088,8) (56) Trome F., Blois F, Olomuck А. Reactions

of nucleic Acid Bases with 2-acetylenlc esters.

Synthesis and enrymatlc evaluation of

chemically modified nucleotldes — Eur, (.

8tochem., 1987, 162; М 2 р; 433 — 437. (54):СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЕВЫХ СО-.

ЛЕЙ БРОМСОДЕРЖАЩИХ 8-ЗАМЕЩЕННЫХ (ИМИДАЗО(2,1-!)ПУРИН ИЛ-3)Р-О-РИ БО ФУРАН ОЗ ИЛ-5 -ФОСФАТОВ (57) Изобретение касается нуклеотидов, в частности получения трилитиевой соли (8(4-(бромацетил)фенил)имидазо(2,1-1)пурин ил-ЗфО-рибофуранозил-5 -трифосфата или литиевой соли {8-(4-(бромметил)-фенил)имидазо(2,1-Цпуранил-3)-D-рибофура" нозил-3,5 -циклофосфата, которые могут быть использованы в качестве флуоресцентных аналогов адениловых нуклеотидов для

Изобретение относится к способу получения новых химических соединений— литиевых солей бромсодержащих 8-замещенных (имидазо(2,1-!)пуринил-3)ф0-рибофуранозил-5 -фосфатов общей формулы " С Щ

ЯР 0Н где й1 атом водорода и R2 — группа форму,, Я.1 „„1713904 А1 селективной модификации активных (или регуляторных) центров соответствующих ферментов, имеющих в районе связывания экзо-ИН2-группы молекулы субстрата определенную нуклеофильную группу, например — SH, а также в биологии для регуляции уровня адениловых нуклеотидов в клетках различных тканей. Цель — создание новых полезных веществ указанного класса. Синтез ведут реакцией Na-солей аденозин-3,5 циклофосфата или Na-солей аденозин-5 -диили трифосфата с 1,1-(1,4-фенилен)бис(2бромэтаном) (Мольное соотношение = 1:(520)) в среде смешивающегося с водой полярного растворителя (N,N-диметилформамид, диоксан, гексаметапол, 1-метилпирролидон-2) в присутствии водного раствора ацетата лития (рН 5 — 6) при 3040 С. Выход, %; спектр флуоресценции при воз6, нм, Жпах, нм, брутто ф-ла: а) 9, 325, 425, С2оН16Вг 1зМ014Р 2Н20; б) 11, 325, 425, С1оН1вВГЫ2И5011Р2 2Н20; в) 15, 325, 425, Я

С2ОН16ВГ1 Н506Р Н20, 1 З.п. Ф-лы, 2 табл.

О и лы Н вЂ” (0 — Р— )и гдЕ n = 2 или 3, или R1 и R2

I., ОЬI+ ФО + образуют группу формулы — P — 0 — Lj .

Получаемые описываемым способом новые соединения могут быть применены в качестве флуоресцентных аналогов адениловых нуклеотидов для селективной модификации активных (или регуляторных) центров соответствующих ферментов, имеющих в районе связывания экзо-NH2-группы молекулы субстрата определенную нуклеофильную группу, например -SH. Кроме того, новые соединения могут быть ис1713904 пользованы в молекулярной биологии для регуляции уровня адениловых нуклеотидов в клетках различных тканей.

Цель изобретения — разработка простого одностадийного способа получения новых реакционноспособных флуоресцентных производных в ряду циклических 1,N -производных адениловых нук6 леотидов.

Указанная цель достигается взаимодействием аденозин-3,5 -циклофосфата или аденозин-5 -ди- или -трифосфата с симметричным бис-(а-бромметил)кетоном при мольном соотношении реагентов, равном

1:(5 — 20) соответственно в среде: смешивающийся с водой полярный органический растворитель — 0,1 — 1,0 M водный раствор ацетата лития (рН 5,0 — 6,0) при 30 — 40 С с последующим выделением целевого продукта известными приемами.

Пример 1. Трилитиевая соль {8-(4(бромацетил)фенил)имидазо(2,1-1)пуринил

-3)j3-О-рибофуранозил-5 -трифосфата.

К раствору 110 мг(0,2 ммоль)динатриевой соли аденозин-5 -трифосфата в 8 мл

0,1 М литий-ацетэтного буфера (pH 6) добавляюто раствор 320 мг (1 ммоль) 1.1 -(1,4-фен илен)бис(2-бромэтанона) в 20 мл свежеперегнанного диметилформамида.

Реакционную смесь термостатируют при

30 С в течение 24 ч, затем добавляют 15 мл воды и экстрагируют эфиром {3x100 мл).

Водный слой после экстракции упаривают при пониженном давлении и 35 С. K остатку добавляют 2 мл безводного этанола, затем

2 мл безводного диэтилового эфира и полученную суспензию центрифугируют, Gcaдок отделяют и высушивают в вакууме. Выделение целевого продукта осуществляют с помощью препаративного высоковольтного электрофореза на бумаге в 0,025 М литийэцетатном буфере (рН 6). Полосу бумаги, содержащую получаемое соединение, идентифицируют в УФ-свете по флуоресценции, вырезают и элюируют водой. Элюат упаривают до обьема 0,5 мл, добавляют 2 мл безводного этанола и затем 5 мл безводного эфира. Осадок отделяют центрифугироваKMGM, промывают указанной смесью и высушивают в вакууме над пятиокисью фосфора.

Получают 12 мг (9 ) целевого продукта.

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл. 1, Пример 2. Дилитиевая соль {8-(4(бромацетил)фенил)имидазо(2, И)пуринил

-3}-P-D-рибофуранозил-5 -дифосфата.

В условиях, аналогичных описанным в примере 1, из 94 мг(0,2 ммоль) динатриевой

Формула изобретения

1. Способ .получения литиевых солей бромсодержащих 8-замещенных(имидазо(2, И)пуринил-3)-P-D-рибофуранозил-5 фосфатов, общей формулы соли аденозин-5 -дифосфата получают 15 мг (11%) целевого продукта.

Физико-химические свойства представлены в табл. 1.

5 Пример 3. Литиевая соль (8-(4-(бромметил)фенил)имидазо(2,1-1)пуринил-3) РО-рибофуранозил-3,5 -циклофосфата.

В условиях, аналогичных описанным в примере 1, из 70 мг (0,2 ммоль) натриевой

10 соли аденозин-3,5 -циклофосфата получают продукт, который очищают с помощью ( препаративной бумажной хроматографии в системе н-бутанол-уксусная кислота-вода (5;2:3). Элюат, содержащий целевой продукт

15 осторожно подщелачивают разбавленным раствороМ гидроокиси лития (рн 6-6,5) и далее обраба ывают как описано в примере 1.

Получают. Я мг (1570) целевого продукта.

Физико-химические свойства представ20 лены в табл. 1.

Пример ы 4 и 5. Дилитиевая соль

18-(4-(бром а цетил)фен ил)имидазо(2,1

-1)пуринил-3)P-D-рибофуранозил-5 -дифосфата, 25 Процесс проводят в условиях, описэнных в примере 2, при значениях параметров, указанных в табл. 2.

П р и М е р 6 (сравнительный), В условиях, аналогичных описанным в

30 примере 1, вводят во взаимодействие 275 мг (0,5 ммоль) динатриевой соли аденозин-5 трифосфата и 1,22 r (5 ммоль) 1,4-дибромбутандиона-2,3. Через 48 ч по данным ТСХ реакционная смесь представляет собой .

35 сложную смесь трудноразделимых продуктов, не содержащую флуоресцирующих сое-.. динений.

Проведение процесса за пределами указанных параметров. приводит к сниже40 нию выхода целевого продукта, а в случае. увеличен я мольного соотношения нуклеотид:бис{бромметил)кетон не наблюдается существенного увеличения выхода.

Таким образом изобретение позволяет

45 получать в достаточно простых условиях реакционно-способные алкилирующие произ( водные адениловых нуклеотидов, обладающие выраженными флуоресцентрыми свойствами (их квантовый выход».

6 квантовому выходу 1,N -этеноаденозина, 50 т.е, -0,5, в отличие от слабофлуоресцирующих 7-оксо-9-хлорметилпиримидо{2,1-i)пуринил-3)j3-О-рибофуранозил-5 -фосфатов).

1713904

B,О где R> — водород; и,О ОН

Rq — группа формулы н 0-Р где и -2 или 3, (-а „ или Й1 и Йг образуют группу формулы о т л и ч а ю щ.и и с я тем, что натриевые соли аденозин-5 -ди-, или -трифосфата, или аденозин-3,5 -циклофосфата, соответственно, вводят во взаимодействие с 1,1 -(1,45 фенилен)бис(2-бромзтаноном) и ри молярном соотношении реагентов 1:(5-20) соответственно, aсреде: :смешивающийся с водой полярный органический растворитель — 0,1-1,0 М водный раствор ацетата

10 лития (рН 5,0-6,0) при 30-40 С.

2. Способ пои. 1, отл ича ю щийс я тем, что в качестве органического растворителя используют N,N-диметилформамид, 15 диоксан, гексаметапол. 1-метилпирролидон-2.

1713904

Ъ4Ъ сЧ мъ

0Ъ сl с Ъ

l е 1

1 с х

z ъо ь а е л с

t41

I сч о

Cl

l0 ст

X т

X.0.

"с44

ОЪ м.Ф

° 44Ъ М оъ

M ФСЧ

c c с с

В

О СЧ 44Ъ

ЧЪ О сЧ счсъм с

Оъ о

44Ъ О

С 4 Cci

Cl

IЧ

Ч0

Т сч

1

;0

Ю

Ю л о оъ

Ю

Ol

ОЭ

lA

VC

LCL

14

Ю м

ЧЪ

CO сч

ЪСЪ с»

OL

CO сч съ с I

М 1 сч е

° Х 4Ъ

LIC Е т о е3 стеа о

m CL

1 0L

Ъ.аве е х л

1- Х !О о х х>т

З

z m е

44 4- а л г

vrx х

Л 40

1 l0 01 с zm

О сс

z, l0, О

I- е ъсъ со 5о

I C0. х то с ъ с0

-Т с Ъ съ м м

Ю м

CCC .Ф с Ъ ъс

Ссс о

Сс я

° 4

»1 м

Cl с

lac O Г

Я сЧ

I 1 I

I m 1 I

V 1 е а

О 1 Э л

С -11т ссч в *

1 I 1 а!

1 I 1 I

1 Y 1 ф

Е! 0 10Ъ с Ят ссч !

441 Z !М ! С0

1 1

l 1 1

1 ICL* 1

I 1 l 1 1

1 О

1 1 V с4 с 4

I I х 1 «МСЧ

at l CO а 0т: м.ЕСЧ

1 14т) I

l 1 l а r

1 I 1 а

1 Х 1 1

1 Ф 1 Z 1

z 1 С С

v с с

1 1 1 »

l e I 44 1 ь

t ЮР44Ъ о О сЧ

I 1 t с!с ЪМ ! ас

НI 1 ш I х цЪ

3 1 wt 1»

Z 1 Ш I CO 1

Ф 1 1,: I

Ф 1 1 1

И

1 1 1 0

1 1 1 т 1

l0 I 1 LO 1 О с 1 1 I 1 ! !х 1

CO I с»

1 I о х m I х о I O

9 1- I I Ct; 1 1

Е Е 1 4 1 аос 1 1

mî l се

О111101СО

0- 1 1 I l I тъсь! 1 Фс

О ! 1 1 Z

1 1 1 1

i0 X 1 1 — --С

С0 1 1 О- I 1

l 0» l !O ет l ! ° !о

Е I I 1

ОО.I I I Z IÑ×

О Л I 1 1 Ф 1

1 1 1 1

ХО 0!

Ф X 1 1 1

Фас mi l ° тз zi c=iм

С-%Р1 С I »X I ЧЪ

X I l0 l 1 l0 т!сЧ

1 Е 1 1 I х

З с lz

1 З I 1 1

m z Iz t ° Iw

Ф I«1 I У 1 СЪ

m l z 1 з

Б Э 1 1 10 I СЧ

X 1 6) 1 — 1 — — 1 с

О 11 1 l ° !О

I I I Cf l с!

Е I I I ст

Ф 1 1 1 l0 1

Z lM

V l lL4

X 1 l — — 1 о

Ф I 1 1 I CI

V» I 1 O

1 1 У 1

Ф I 1 3I 1 т ! 1 О! M

0 I Ъ» т I ю

Z 1 Е 1 Р с +

Х 1 Л о т ИЪ о а 1 о 1 ю

x e l 4

Ф 1 1 1 1

x о 1 1

I- 00

I 1- 14 л хс„х а 1 C 4

I 444 v м

1 °

1 m x I ооа

c4 C Cc

I

1

1

1 ! ! !

1

1

1

1

1

1

t

1

C»!

I

1

1

С 1

1

1 сЧ I м 1

I

1

1 I

1

t.

l

1

1

1

1

1

1

I

I !

1

1

1

I

1 !

1

1

I

1

1 !

1

1

I

1

1

I

1

I

1

I

1

1

I

1

1

l

I о ! е

1

1

1713904

Таблица 2

Составитель Г. Коннова

Редактор С. Патрушева Техред М.Моргентал Корректор M. Максимишинец

Заказ 660 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Йроизводственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101