Способ определения клеточного иммунитета к вирусу гриппа

 

Изобретение относится к методам диагностики . Целью изобретения является упрощение способа. Это достигается тем, что в способе определения клеточного иммунитета к вирусу группа по цитотоксическому поражению иммунными менфоцитами клеток системы фагоцитирующих менонуклеар з, зараженных вирусом, в качестве фагоцитирующих мононуКлеаров используют моноциты периферической крови и при увеличении иитотоксической активности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определяют клеточный иммунитет к вирусу группа.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4445109/14 (22) 20,06.88 (46) 15,12.91. Бюл, N. 46 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (72) 6,Н.Смирнов, И,И,Торопова и Г.А.Мохова (53) 615,475(088.8) (56) J.lmmunol. Meth. 1984, 68, 1-2, 205 — 215, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА К ВИРУСУ ГРИППА

Изобретение относится к. медицине, в частности к методам диагностики.

Цель изобретения — упрощение способа путем использования в качестве клеток системы фагоцитирующих макрофагов моноцитов периферической крови.

Это достигается тем, что в качестве фагоцитирующих мононуклеаров используют моноциты периферической крови и по увеличению цитотоксической активности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определяют клеточный иммунитет к вирусу гриппа, Пример 1. Испытуемый доброволец

Б. исследован через 21 день после ревакцинации живой противогриппозной вакциной

А (Новошахтинск, 1(86), Из локтевой вены шприцем взяли 6 мл крови и перенесли во флакон, содержащий 120 ед. гепарина, Кровь развели до 15 мл питательной средой (среда Игла, содержащая 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки

20 ед/мл гепарина и 100 мкгlмл мономицина и по 7,5 мл наслаивали на 3 мл градиента

». Ж» 1698680 Al (я) G 01 N 1/28, 33/48 (57) Изобретение относится к методам диагностики. Целью изобретения является упрощение способа, Это достигается тем, что в способе on ределения клеточного иммунитвта к вирусу группа по цитотоксическому поражению иммунными менфоцитами клеток системы фагоцитирующих менонуклеар з, зараженных вирусом, в качестве фагоцп-ирующих мононуклеаров используют моноциты периферической крови и при увеличении цитотоксической активности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определяют клеточный иммунитет к вирусу группа, фиколлверографин с плотностью 1,077 г/см .

После центрифугирсвания (35 мин при 1500 об/мин) взяли интерфазу, содержащую Мононуклеарные клетки, отмыли в 10 мл питательной среды, отцентрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, осадок развели 10 мл питательной среды и осуществили разделение мононуклеарной суспензии на прилипающие и не прилипающие клетки, С этой целью суспензию мононуклеарных клеток перенесли во флакон для клеточных культур (125 мл). Флакон инкубировали при 37 С в течение 1 ч. Затем жидкость, содержащую лимфоциты, отбирали и сохраняли при 37 С до использования, Перед применением в качестве эффекторов клеточную суспензию центрифуги ровали

10 мин при 1500 об/мин, осадок оазводили питательной средой до соответствующей концентрации.

Для снятия прилипших клеток во флакон наливали 6 мл 10 мм раствора ЭДТА, разведенного питательной средой 1/1, и инкубировали 15 мин при 37 С, Далее жид1698680

Составитель B.Бабинков

Техред M.Ìopãeíòàë Корректор Т,Палий

Редактор H.Ôeäopoeà

Заказ 438 / TNpe>K Подписное

В. - !!ИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент",.г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 кость сливали, клетки осаждали и дважды промывали питательной средой (режим центрифугирования — 10 мин при 1500 об/мин).

Клеточныи Осадок. со Вер>кащий 900 моноцитов, разводили питательной средой и рассеивали в полистироловую 96-луночную круглодонную микроплату по 200 тыс, клеток на лунку в объеме 0,2 мл, всего использовали 15 лунок. Микроплату оставляли на ночь (16 ч) в термостате при 37 С. Затвм клеточный монослой заражали вирусом гриппа А (РР) 34 (Н1И1), используя стерильну о Вирусосодержащу о аллантоисную жидкос ь (ВАЖ) развивающихся куриных эмбрионов, разведенную до титра гемагглю гининз 10 (0,2 мл), ПредВарительно из лунок с моноцитами удаляли надосадочную жидкость, лунки промывали питательной средой "i i!ocf!e oT6ope последней наносили

БАМК по 0,2 мл -а лунку . После инкубации в .:e :e!-:ие 1 . при 3i C BAR удаляли, лунки ,r-: eç>KÖû и >ОмыВали средой Игла, добаВляли по О,.- . мл питательной соеды N продолжали инкубирование при 37 С в течение 4 ч. Зате". :надосадочную >кицкость удаляли, клетки промывали срецой Игла и добавляли ... ы .Ок" — :- ейтральный красный по 0,2 мл на л,.",;.:, В D,",.öe 0,04 /:-ного раствора В среде

::, e:— .;:Ce, После инкубации при 37 C надосадочн4!o >килкость удаляли, клеточный мои Осл ай г. ООмы Вали средой Игла, добавляли пит,тГел ьич!О c pal M инкубиповлли 1 i при

З-,г" С

За-ем в 5 лунах после удаления питательной среды добавляли суспензию лимфоцитов — 860 Tb!c.êëåòoê B Объеме 0,2 мл питательной среды на лунку (соотношение моноцитов и лимфоцитов 1:4,3), в остальных

10 лунках с моноцитами меняли питательную среду и микроплату Оставляли для инкуаации при 37 С в течение 16 ч, После Окончания инкубации надосадоч- ну О жидкость сливали, микроплату дважды промывали путем погружения в забуференный О,О0!,-ный раствор хлористого натрия (рН 7,2), Нейтральный красный освобождали из моноцитов добавлением в каждую лун-, ку на 10 мин 0,2 мл 0,05 M раствора уксусной кислоты в 50 этанола. Смесь из лунок отбирали, доводили до объема 1 мл забуфе5 ренным 0,9%-ным раствором хлористого натрия и определяли оптическую плотность на спектрофотометре (СФ-26) при 540 нм против контрольного раствора (0,2 мл 0,05М уксусной кислоты в 50 j этаноле+О, 8 мл

10 забуференного 0,9 -ного раствора хлористого натрия), Для осуществления способа потребовалось 48 ч.

Оптическая плотность жидкости из 10

15 лунок с моноцитами равнялась в среднем

0,08 0,02. Оптическая плотность жидкости из 5 лунок, содержащих моноциты и лимфоциты, равнялась 0,03 +. 0,01. Различие статистически достоверно (Р< 0,05), Лизис

20 моноцитов 63 .

При исследовании цитотоксической активности лимфоцитов крови данногс волонтера в периоде до вакцинации и через 8 дней после вакцинации лизис моноцитов

25 составил соответственно 9 и 3%.

Результаты исследов-.ния свидетельствовали О поВышении цитОтоксической активности лимфоцитов вакцинированных лиц к моноцитам, инфицированным виру30 сом гриппа, формировании у них клеточного иммунитета.

Формула изобретения

Способ определения клеточного иммунитета к вирусу гриппа по цитотоксическому

35 поражению иммунными лимфоцитами клеток системы фагоцитиру|ощих мононуклеаров, зараженных вирусом, о т л и ч а ю щ и ис я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве фагоцитирующих мононуклеаров

40 используют моноциты периферической крови и при увеличении цитотоксической актив ности лимфоцитов сенсибилизированных лиц определя от клеточный иммунитет к вирусу гриппа, 45