Способ обнаружения присутствия вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину

 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к способу обнаружения вируса иммунодефицита человека или другого вируса , дающего аналогичную клиническую картину. У больных с синдромом заболевания лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДу комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), выделены и идентифицированы индуцируемые HIV ингибиторы РН-азы L. У таких пациентов функциональные 2-5А не способны активировать РН-азу L в моноядерных клетках периферийной крови, эндогенная дзРНК, в особенности неспаренная дзРНК, активирует 2-5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2- 5А. Установлено, что наличие ингибитора РНК-азы является маркером присутствия СПИД, СЗЛ или РСК. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я>5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4355467/13 (22) 03.03.88 (31) 136978 (32) 27.12.87 (33) US (46) 23.10,91. Бюл. М 39 (71) Хем Рисерч l4HK (US) (72) Вилльям А.Картер (US) (53) 576.8.094.29 (088.8) (56) Р ойеу et aL Science, 1986, 234, 1392-1395. (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРИСУТСТВИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ДРУГОГО ВИРУСА, ДАЮЩЕГО

АНАЛОГИЧНУЮ КЛИНИЧЕСКУЮ КАРТИНУ (57) Изобретение относится к вирусологии, в частности к способу обнаружения вируса

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к способу обнаружения вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину..

Открыто ингибирующее вещество, выделяющееся или понуждаемое к выделению клетками, инфицированными вирусами иммунодефицита человека. Этот ингибитор, видимо, физически связан с ферментом PHазой L — конечным продуктом в системе 2, 5 -олигоаденилят-PH-аза L, и приводит к выходу из строя всей иммунной системы, что позволяет вирусам бесконтрольно мультиплицироваться. Описаны методики идентификации таких ингибиторов либо непосредственно, либо косвенно по отсутствию PH-азы L или неактивности PH-азы L, либо по присутствию промежуточных биохимических веществ в системе 2 -5 А-PH-аза,, Ы„„1687035 АЗ иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину. У больных с синдромом заболевания лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДУ комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), выделены и идентифицированы индуцируемые HIV ингибиторы PH-азы L. У таких пациентов функциональные 2 — 5А не способны активировать РН-азу L в моноядерных клетках периферийной крови, эндогенная дзРНК, в особенности неспаренная дэРНК, активирует 2-5А-синтетаэу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2—

5А. Установлено, что наличие ингибитора

PHK-азы является маркером присутствия

СПИД, СЗЛ или РСК, 1 табл.

L, при этом ингибитор служит маркером для обнаружения присутствия НИ или родственных вирусов, Дающих по существу аналогичную клиническую картину, Обсуждается также прогнозирующее значение такого маркера с точки зрения развития СПИДа в полном расцвете у больных, в частности у больных, имеющих антитела к

Н!Ч в периферийной крови и тканях;::в том числе крови, фракциях крови, клетках:трансплантированных органов и клеточных экстрактах. Описаны способы активации

PH-азы L или дезактивации ингибирующего

PH-азу L вещества. Частью предлагаемого изобретения являются лечебные методы борьбы со СПИДом и родственными вирусами и контроля развития таких вирусов путем активации РН-азы L e/или удаления, или дезактивации ингибирующего РН-азу L вещества (веществ),или направленного на ин1687035 гибиторы вируса. В предлагаемое изобретение включены способы получения антител к указанным вирусам как In vlvî, так и in vitro, использованием в качестве антигена специфичного ингибитора РН-азы L или направляемых вирусом ингибиторов биохимических промежуточных веществ в системе 2 -5A -РНаза 1.

В экстрактах моноядерных клеток периферийной крови(МКПК) людей с синдромом заболевания лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДУ комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), замерены компоненты системы 2-5А-синтетаза-PH-аэа 1, Уровень

2-5А-синтетазы в высшей степени завышен у больных СПИДом и находится на баэальном уровне у больных РСКом или СЗЛом.

Однако, вне зависимости от колебаний концентрации 2-5А-синтетаэы (2-5А) высокие эндогенные концентрации 2-5А (до 35 нМ) обнаружены у больных СЗЛом„РСКом и

СПИДом. Зкстракты 2-5А на деле оказались функциональными, о чем свидетельствуют испытания на связывание, расщепление рибосомной РНК и испытание с ядро-целлюлозой. Несмотря на повышенные концентрации эндогенной функциональной

2-5А, ни для одного из больных СЗЛом, РСКом или СПИДом не могла быть показана активированная PH-аэа L Однако у всех здоровых людей PH-aaa L в МКПК была активирована, даже несмотря на то, что концентрации эндогенной 2-5А составляли менее 5 нМ. Опыты со смешиванием свиде1 тсльствуют о присутствии ингибитора РНазы 1 у пяти больных СЗЛом, РСКом и

СПИДом, Такой ингибитор может переноситься и может препятствовать индуцируемому 2 — 5А специфичному для рН-азы L разрушению рРНК в экстрактах клеток

L929. Один из таких ингибиторов PH-аэы осаждается трихлоруксусной кислотой (ТХК) и этанолом, Ингибирование действия РНазы L снимается обработксй РН-азой А или протеазой. Исследования предполагают, что в МКПК больных СЗЛом, РСКом или

СПИДом зндогенная дзРНК активирует 25А-синтетаэу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2-5А. Способности функциональных 2-5А активировать PHазы L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и

СП ИДом.

Определение концентрации 2-5А и функционирования РН-аэы L в экстрактах

МКПК с использованием специфичных и чувствительных определений показывает то, что дефект противовирусной системы 25А-синтетаза-РН-аза 1. в МКПК больных

СЗЛом, РСКом и СПИДом заключается в

40 присутствии ингибитора PH-азы L, но не в синтезе нефункциональных 2-5А. Приводимые здесь данные подчеркивают, что кажущиеся парадоксальными взаимодействия, происходящие в инфицированной вирусом клетке, могут быть теперь объяснены рациональными согласованными биохимическими понятиями.

Связанную с акриловыми шариками (1 мг) PH-аэу А или связанную с карбоксиметилцеллюлозой (1 мг) (Sigma chemical Со) вымачивают в NP40 лиэисном буфере (16),. (10 мкл) 2 ч при 30 С, после чего смешивают с экстрактом МКПК (100 мкг на испытание) до окончательного объема 15 мкл и дополнительно инкубируют 2 ч при 30 С. Во время повторного инкубирования содержимое пробирок осторожно несколько раз перемешивают. Контрольные образцы инкубируют без всякого добавления фермента, Иммобилиэованные ферменты осаждают центрифугированием (10000х g, 5 мин, комнатная температура). Пять микролитров центрифугированных фракций добавляют к экстрактам клеток L929 (150 мкг белка на испытание) и проводят испытания по расщеплению рРНК для определения специфичной для PH-азы L активности.

Выделенные иэ экстрактов МКПК эндогенные 2-5А данные характеризуют проведением испытаний по расцеплению рРНК.

Образованные при расщеплении PH-азой ( продукты с выделенными из МКПК 2-5А значительно отличаются в экстрактах клеток

L929 от продуктов, полученных с аутентичными 2-5А. Например, зндогенные 2-5А, выделенные из МКПК, активируют PH-аэу L из клеток L929 с расщеплением 28S и 18S рРНК и образованием трех специфичных продуктов расщепления. Объяснение наблюдаемых различий в продуктах расщепления может заключаться в том, что эндогенные 2-5А, синтеэируемые в МКПК, отличаются. от аутентичных 2-5А.

Для выявления уровня свободной (не-25А-активированной) PH-азы L, являющейся целевым ферментом для 2-5А, использовано испытание с радиосвязыванием. Могут быть также использованы и другие целевые ферменты. В экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом уровень свободной PHазы L в 5-7 раэ выше, чем у здоровых людей.

Однако испытание на радиосвязывание имеет ограниченное значение для образцов, в котооых эндагенные 2-5А конкурируют с рзА / P/ðÑð эа связывание с РН-азой

L. Соответственно, результаты испытаний по радиосвязыванию точно не отражают уровень PH-аэы L. Таким образом, существенно определение уровня 2-5А-активиро-.

1687035

10

20

35

55 ванной PH-азы L, Для достижения этого использован новый чувствительный метод, позволяющий определять активированную

PH-азу L в экстрактах МКПК, выделенных всего лишь из одного миллилитра периферийной крови, и этот метод основан на специФичности расщепления 2-5А-активированной РНазы на рРНК.

Вследствие того, что рРНК присутствует в МКПК ниже уровня детектирования, экстракты клеток HL 929 (субклон штамма клеток L 929 с дефицитом РН-азы L) используют в качестве источника рРНК. Использованием этого метода удалось показать, что

PH-аза L неактивна в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, где имеет место высокое внутриклеточное аккумулирование функциональных 2-5А.

Экстракты МКПК от всех здоровых людей, подвергшихся испытанию, показали присутствие активной PH-азы L, дающей специфичные продукты расщепления несмотря на то, что 2-5А присутствует в концентрации L

5 нМ.

В экстрактах МКПК, инфицированных

СЗЛом, РСКом и СПИДом больных, присутствуют биологически активные 2-5А. Почему же неактивна PH-аза L.Для определения того, является ли отсутствие активности PHазы L следствием нефункциональности PHазы I или следствием присутствия ингибитора активности PH-азы L, проведены следующие опыты со смешиванием..

Экстракты клеток L929, содержащие функциональную PH-азу, смешивают и совместно инкубируют с экстрактами МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, Специфичных продуктов расщепления для P H-азы

L не обнаружено, Эндогенные 2-5А, ответственные за активацию PH-азы L, дают по меньшей мере четырехкратное разбавление относительно клеточных экстрактов, из которых эти образцы происходят. Эти данные указывают на присутствие нерастворимого в ТХК ингибитора (ингибиторов) PH-азы L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Такой ингибитор не обнаружен у здоровых людей, поскольку их экстракты MKilK генерируют специфичные для PH-азы L продукты расщепления после совместного инкубирования с экстрактами клеток L929, Точно так же растворимая фракция ТХК МКПК от здорового человека генерирует специфичные продукты распада, Присутствие функциональных 2-5А и тат факт, что предполагаемый ингибитор PH-азы осаждается ТХК и этанолом, наводит на мысль атом, что ингибитор РН-азы L не является аналогом 2-5А, как недавно идентифицировалась в клеточных культурах, инфицированных HSV-1 и ретровирусом.

Опыты с использованием разрушающих ферментов, иммобилизаванных на твердых носителях, дают совершенно новое представление о природе ингибитора (ингибиторов) PH-азы L, найденных в экстрактах

МКПК больных Сзлом, Рском и СПИДОМ.

Если экстракты МКПК больных СПИДом предварительно инкубируют с иммобизированной протеазой или PH-азой А и затем совместно инкубируют с экстрактами клеток L929, активность P H-азы L восстанавливается, о чем свидетельствует появление специфичных продуктов расщепления.

Настоящие исследования показывают, что дефект в противовирусной системе 2-5Асинтетаза-PH-аза L в МКПК больных

СЗЛом, РСКом и СПИДом может быть отнесен за счет ингибитора РН-азы 1, а нее за счет отсутствия функциональных 2-5А. Ингибитор PH-азы L присутствует в экстрактах

МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, что указывает на воэможность существования ингибитора на всех стадиях развития типичных ретровирусных заболеваний и что этот ингибитор также имеет отношение к различным субострым (хроническим вирусным) патогенным инфекциям, С учетом того, что во всех случаях МКПК больных СЗЛом, РСКом или СПИДом, подвергшихся испытанию, содержат PНК НИ (определено молекулярной гибридизацией) и центры инфицирования HIV (определено совместным культивированием лимфоцитов), вполне вероятно, что ингибитор PH-азы 1 индуцируется вирусом.

Репликация вируса модифицирует систему 2-5А-синтетаза-РН-аза L таким образом, что естественное противовирусное состояние не может быть в полной мере экспрессировано или отрегулировано, Вполне вероятно, что белок (и), и PHK (ы), закодированные HIV или другим сосуществующим с ним ретровирусом, могут ингибировать активацию PH-азы L.

Пример. Моноядерные клетки периферийной крови (МКПК) выделяют на FlcollHypagu, клетки L929 и HL929 (субклон L929 с дефицитом PH-азы L) получают в культуре с монаслаем, цитаплазматические экстракты клеток L929 и HL929 получают в глицериновом буфере, экстракты МКПК получают в

NP40 лизиснам буфере согласно известным методикам, Концентрация белка в экстрактах 115 мкг/мKh.

Активность 2-5А-синтетазы определяют в выделенных экстрактах МКПК (50 мкг ча испытание) использованием пали (1)-па1687035

40 ли(С)-агарозы. 2-5А выделяют из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКПК после нейтрализации фреоном-три-н-актиламином. Экстрагированные ТХК 2-5А затем лиофилизуют и вновь растворяют в воде таким образом, что все образцы стандартизированы в объеме воды до эквивалента в 5 мкг белка на 1 мкл. Концентрации 2-5А, присутствующие в экстрактах МКПК, измеряют в испытании на радиосвязьвание с экстрактами клеток L929 в качестве источника РНазы 1 . Из 18900 dpm рзАа/ 2/Р/рСр (удельная активность 3000 Ci/ммоль, Amersham), добавленных на одно испытание, 19400 dpm связываются. и РН-азой в отсутствие 2-5А. Примерно 9-14 рзА4/ /Р/рСр замещается в испытаниях, в которых добавляют 5 мкл выделенных обраэцов 2 — 5А. Концентрацию.2-5А в МКПК определяют сравнением с калибровочной кривой для аутентичных 2-5А, это определение основано на подсчете концентрации цитоплазмического белка в 25 мкг/мл, Концентрацию 2-5А, выделенных из МКПК, также измеряют в испытании с адроцеллюлозой с клетками L929 в качестве источника

РН-азы L. Активация РН-азы L в таком испытании основана на превращении поли (U)/ Р/рСр в растворимые в кислоте фрагменты. Пуимерно 5-20% всего количества поли (LI)/ Р/рСр (15000 dpm) расщепляется в присутствии 2,5 мкл выделенных образцов

2-5А. Концентрации определяют по калибровочным кривым для аутеничных 2-5А.

Уровень свободной PHI-азы L измеряют при испытании на радиосвязывание после добавления 20000 dpm рз/А4/ Р/рСр к экстрактам МКПК (50 мкг белка на испытание).

Активность 2-5А-синтетазы, концентрация эндогенных 2-5А, уровень свободной

РН-азы L и присутствие ингибитора РН-азы

L в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом приведены в таблице.

Активность индуцированного интерфероном фермента (2-5А-синтетазы) в экстрактах МКПК, полученных от больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, измеряют in vitro и сравнивают с активностью экстрактов от здоровых людей (таблица). Концентрации

2-5А-синтетазы у больных СПИДом (3 и 5) были в 16 и 20 раз выше, чем у нормальных пациентов (таблица). И напротив, концентрации 2-5А-синтетазы у больных СЗЛом (4), РСКом (Ж) и СПИДом с саркомой Капоши (СК) (a4) выше всего лишь в 1,3 — 5 раз, что подтверждают сделанные другими основные наблюдения.

Для определения того, являются ли такие. измерения In vitro 2-5А-синтетазы указанием на функциональность фермента in ч Ьо, из М КП К экстра гируют 2-5А, Биологическую активность 2-5А из растворимых в

ТХК фракций экстрактов М КП К усиленно характеризуют в испытаниях на радиосвязывание и испытаниях с ядро-целлюлозой.

Концентрации 2-5А аналогичны при испытании двумя методами (таблица). Сходность результатов, полученных методами А и В (таблица), указывает на то, что 2 — 5А, выделен н ые из экстра кто в М КП К чело века, могут связываться и активизировать PH-азу L из клеток L929 в той же степени, что и аутентичные 2-5А.

Видимое отсутствие количественной корреляции между уровнями 2 — 5А-синтетазы и эндогенными 2-5А при СЗЛ, PCK u

СПИД (таблица) может быть впервые объяснено следующим образом. Определение 25А-c HTeTaav e испытаниях in vitro основано на частичной очистке через поли (г!)-поли(гС)-агарозу, соответственно, в таком испытании измеряют только свободную

2-5А-синтетазу, а не 2-5А-синтетазу, активированную in vivî с помощью дзРНК, Однако, непосредственно измеряют эндогенную 25А-синтетазу плюс деградируемые 2-5Аферменты (например, 2 -фосфодиэстераза и фосфатазы). Таким образом, аккумулирование 2-5А МКПК больных СЗЛом, РСКом и

СПИДом указывает на низкую активность деградируемых 2-5А-ферментов. Присутствие 2-5А в МКПК также указывает на то, что существует эндогенная дзРНК, до сего времени не обнаруживаемая как у здоровых людей, так и у больных СПИДом.

Формула изобретения

Способ обнаружения присутствия вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину, включающий определение присутствия биологического маркера в пробе биологического материала, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве маркера используют инГИбИТОР РНК-азы L, а в качестве биологического материала используют моноядерные клетки периферической крови, 1687035

Ингибирована

И

ФФ

В1

Неингиби рована стандартное отклонение <9Х; определено в испытании по радиосвязыванию (дублировано); определено в испытании с ядро-целлюлозой (дублировано), стандартное отклонение <1Х; определено в испытании по радиосвязыванию (дублировано), стандартное отклонение (103; определено в испытании по расщеплению рРНЕ; в среднем для 7 контрольных образцов (дублировано); не определялось, Примечание. абвд еНО

Составитель И.Тареева

Редактор Л.Гратилло Техред М,Моргентал Корректор M.Ïîæî

Заказ 8613 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Ф1 сЗл

4Ф 2 РСК

Ю 3 спиД

М4 СПИД+СК

Ю5 спиН

НОРМА

13

157

18

32 .21

24

НО 280

31 270

35 270

15 260

25 240

НО 1630