Способ получения цитохрома с из дрожжей вида candida valida

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве и научных исследованиях. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа. Цель достигается тем, что выделение заключается в дезинтеграции клеток, экстракции цитохрома C 0,8 - 1 М раствором хлорида натрия, после чего экстракт фракционируют и концентрируют с помощью мембранной фильтрации. Негемовые белки отделяют подкислением. Цитохром C осаждают в виде комплекса с кадмием, который затем разрушают гидроксидом аммония. Далее цитохром C очищают с помощью ионообменной хроматографии и лиофилизируют. Выход составляет 630 - 680 мг/кг сухой биомассы, чистота препарата 99%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 9/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4475221/13 (22) 12.08.88 (46).15,07.91. Бюл. № 26 (71) Московский институт тонкой химической технологии (72) Д,В.Журавлева, M,А.Кулиш, А.Ф.Миронов, В.И.Козлов и Е.Р,Давидов (53) 576.8.034 (088.8) (56) Заявка Японии ¹ 45-25266, кл. С 12 С 11/00, опублик, 1973.

Авторское свидетельство СССР № 1242523, кл. С 12 P 1/06, 1983, Авторское свидетельство СССР

¹877934,,кл,,С 12 N 9/00, 1979.

Авторское свидетельство СССР № 1563698, кл, С 12 N 9/00, 1987.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в сельском хозяйстве и медицине, Цель изобретения — упрощение и ускорение способа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. К 2,5 кг сырой биомассы

Candlda valida, что соответствует 0,6 кг сухой биомассы, добавляют 4,25 л,1 М раствора хлорида натрия и подвергают дезинтеграции в баллистической мельнице при температуре 4 — 8 С. Полученный дезинтеграт центрифугируют при 3000 об/мин, осадок промывают 2 л 1 M раствора хлорида натрия. Супернатант фракционируют путем ультрафильтрации на мембранах М!Шроге

ЯЛ 1663024 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА С

ИЗ ДРОЖЖЕЙ ВИДА CANDIDA VALIDA (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве и научных исследованиях. Цель изобретения — упрощение и ускорение способа. Выделение заключается в дезинтеграции клеток, экстракции цитохрома С 0,8 — 1,0 М раствором хлорида натрия, после чего экстракт фракционируют и концентрируют с помощью мембранной фильтрации. Негемовые белкь. отделяют подкислением. Цитохром С осаждают в виде комплекса с кадмием, который затем разрушают гидроксидом аммония, Далее цитохром С очищают с помощью ионообменной хроматографии и лиофилизируют. Выход составляет 630 — 680 мг/кг сухой биомассы, чи-, стота препарата 99 .

100000, 300000 и 1000 дальтон, после чего фракцию, обогащенную цитохромом С, концентрируют на мембране 1000 дальтон.

Полученный раствор имеет обьем 200 мл и концентрацию 2,9 — 3,5 мгlмл. его подкисляют до рН 4,0-4,2, выдерживают 20 мин при

4 С и отделяют выпавшие негемовые белки центрифугирования при 500 об/мин. К супернатанту добавляют 20 мл раствора, содержащего 0,25 — 0,30 M сульфата кадмия и

0,5 — 0,6 M иодида натрия. Через 20 мин осадок отделяют центрифугированием при

5000 об/мин, промывают 0,2 М раствором иодида натрия, затем водой. Осадок растворяют в 10 мл 1 -ного раствора гидроксида аммония, разбавляют 20 мл дистиллированной воды и наносят на ионообменную ко1663024

Составитель Д.Папковский

Редактор M,Íåäoëóæåíêî Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор M.Øàðoøè

Заказ 2237 Тираж 366 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. ужгород, ул.Гагарина, 101 лонку с катионитом К-6 в Н+ форме, рН

8,0 — 8,5. Колонку промывают дистиллированной водой, цитохром С смывают 0,5 М раствором гидроксида аммония, затем лиофилизуют. Выход составляет 380 мг. Соотношение поглощения при длинах волн (550 окисл.) — (280 восст,) лежит в пределах 1,28—

1,29. Чистота, определенная спектральным методом, по содержанию железа и электрофоретически, составляет 99 .

Пример 2. 2,5 кг сырой биомассы

Candida valida ВСБ-934 обрабатывают, как в примере 1, используя для экстракции 0,9

M хлорид натрия до процесса осаждения кадмиевого комплекса цитохрома С. После отделения негемовых белков, которое проводят при рН 3,8 — 4,0, к супернатанту добавляют 14 — 16 мл раствора, содержащего 0 3 М сульфата кадмия и 1,4 M иодида калия, Дальнейшая очистка проводится, как описано в примере 1. Выход составляет 405 мг, чистота продукта 99, Пример 3, 2,5 кг сырой биомассы

СапдЫа valida ВСБ-94 обрабатывают, как указано в примере 1, используя 0,8 M хлорид натрия. Осаждение кадмиевого комплекса цитохрома С проводят раствором, содержащим 0,33 M хлорида кадмия и 1,6

M иодида натрия, Для обработки данного количества фильтрата необходимо 10 — 12 мл раствора. Растворение осадка и снятие цитохрома С с колонки осуществляется 0,4 M аммоний карбонатным буфером, что позволяет поддерживать рН раствора цитохрома

С в пределах 8,5-9,0. Дальнейшая очистка, как в примере 1, Выход 395 Mf, чистота продукта 99 .

Пример 4. 2,5 кг сырой биомассы

Candida virilis ВСБ-651 обрабатывают и очи5 щают, как указано в примере 1, используя для экстракции 0,8 M хлорид натрия, Выход цитохрома С составил 385 мг, чистота 99 .

Пример 5. 2,5 кг сырой биомассы

Candlda crusli ВСБ-729 обрабатывают, как

10 указано в примере 1. Осаждение кадмиевого комплекса цитохрома С проводят раствором, содержащим 0,3 M сульфата кадмия и

1,5 M иодида натрия, взятым в количестве

11 мл, Дальнейшая очистка осуществляется

15 по примеру 1. Выход 402 мг, чистота 99 .

Формула изобретения

Способ получения цитохрома С из дрожжей вида Candlda valida, предусматри20 вающий дезинтеграцию клеток, экстракцию белков 0,8 — 1,0 молярным раствором хлорида натрия, фракционирование и концентрирование экстракта с помощью мембранной ультрафильтрации, хроматографическую

25 очистку на катионите и лиофильное высушивание, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, фракцию цитохрома С после ультрафильтрации подкисляют до рН 3,8 — 4,2 с последующим цен30 трифугированием, супернатанта осаждают цитохром с добавлением раствора, содержащего 0.25-0 33 М соли кадмия и

0,5-1,6 M иодида натрия или калия, после чего осадок растворяют в 1 — 2 -ном раство35 ре гидроксида аммония,