Способ определения молочной кислоты

 

Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения метаболитов с помощью ферментных электродов Цель изобретения - повышение чувствительности . Способ заключается в том, что в качестве ферментного сенсора используют кислородный электрод с иммобилизованными клетками аэрококков Aerococcus virldans ВНИИА 1688(167 VR)c повышенной способностью окисления молочной кислоты Скоростьпоглощениякислорода дополнительно усиливается с помощью введения в реакционную смесь 0,1 М D-L-tt-аланина. Объем анализируемой пробы 20 мкл, чувствительность способа 0,1 мкМ. время формирования сигнала 2,9 - 4.1 с, время возвращения сигнала на базовый уровень при отмывке электрода от метаболитов 3-5 с, интервал линейности калибровочного графика 0,5 - 5 мкм. Электрод стабилен в течение 2 мес при хранении при 4°С. 2 табл. 1 ил. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 0.1/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4651279/13. (22) 17.01.89 (46) 15.06.91. Бюл ЛФ22 (71) Днепропетровский медицинский институт и Днепропетровский государствекный университет им. 300-летия воссоединения .

Украины с Россией . (72) Г.Н.Кременчуцкий, П.Я.Арейков»

Э.Н.Шарун и B.Â.Áèöêèé (53) 543.9 (088,8), (56) Mascinl.M., Fortunati S., Malone О., PaIleshl 6„Маээ!-Benedetti M., Fabiettl Р;:An

1=lactate sensor with ImmobIHzed enzyme for

use ln чЬо studies with endocrine artificial

pancreas. — ClInIcal ChemIstry, 1985. v;31, М 3, р. 451 — 453.

Adamovicz Е., Bursteln С. lactate

enzyme electrode, obtained with |влтоЬНФ еб

respiratory chain from EscherIchia coH and

oxygen probe for specific determination of

1-lactate in yogurt, wine- and Ыооб.—

- Blosensors, 1987 — 88, ч,3, М1, р.27 —. 43, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛОЧЙОЙ

КИСЛОТЫ

Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения метаболитов с помощью ферментных.электродов.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуру Aегоcoccus vlrldans (коллекция ВНИИА, 1988, 167 VR) выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 — 100 мкг 01:лактата лития, 30 — 50 мкг грамурина и 2 — 5 мкг этония на 1 мл среды при 32 — 3%C в течение 36 — 48 ч. Выросший

„„59„„1655988 А1 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения метаболитов с помощью ферментных электродов.

Цель изобретения — повышение чувствительности. Способ заключается в том, что в качестве ферментного сенсора используют кислородный электрод с иммобилизованными клетками аэрококков Aегоcoccus virldans

ВНИИА 1688(167 VR) c повышенной способностью окисления молочной кислоты. Скорость поглощения кислорода дополнительно усиливается с помощью введения в реакционную смесь 0,1 М D-(-а-аланина. Объем анализируемой пробы 20 мкл, чувствительность.способа 0,1 мкМ, время формирования сигнала 2,9 — 4.1 с, время возвращения сигнала на базовый уровень при отмывке электрода от метаболитов 3 — 5 с, интервал линейности калибровочного графика 0,5 — 5 мкм. Электрод стабилен в течение 2 мес при хранении при 4 С. 2 табл.

1 ил. налет смывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 — 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2 — 7.4) с центрифугированием при 3000 об/мин.

На мембрану перевернутого сенсорной частью вверх электрода Кларка наносят 50 мкл смеси, состоящей из 2,7мл 0,1 M фосфатного буфера (рН 6,6 — 6,8},. 1,5 мл

17,5 -ного бычьего сывороточного альбумина и 100 мг влажного веса отлитой биоюассы клеток. Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны.

1655988

Добавляют 10 мкл 10%-ного глутарового альдегида с быстрым распределением его по поверхности мембраны стеклянной и 3il 04 кой.

Ф

Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при +4 С в течение 8 ч, после чего ферментный слой накрывают диализной мембраной; Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 M фосфатный буфер (рН 7,2—

7,4), Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 10 мкл биологического образца и 10 мкл 0,1 М раствора DL- a-аланина.

Сенсорную часть электрода вводят в

Микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения (4, выражаемой в нМ поглощенного 02 в 1 мин. Производят рас ет концентрации молочной кислоты в обаэце согласно калибровочной кривой ависимости скорости поглощения Oz npu окислении DL-лактата лития в определенйых концентрациях.

В табл.1 приведены данные по скорости окисления О и L-стереоизомеров молочной кислоты в присутствии 0,1 М DL-а-аланина и без него.

На чертеже приведен пример калибровочного графика. Интервал линейности составляет 0,5 -5,0 мкМ лактата.

В табл.2 показано стимулирующее действие предельных и оптимальных концентраций DL- . а -аланина на окисление И=лактата.

Пример 1. Культуру Aегоcoccus

viridans 167 VR (коллекция ВНИИА, hh 1688) . выращивают на твердой питательной среде, одержащей 50 мкг/мл DL-лактата лития, 0 мкг/мл грамурина и 2 мкг/м этония, при

32 C в течение 36 ч. Выросший налет смыфают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,2—

7,4), отмывают дважды 0,01 M фосфатным буфером (рН 7,2 — 7,4) центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин.

На мембрану перевернутого сенсорной

Частью вверх электрода наносят 50 мкл смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,8) и 1,5 мл 17,5%-ного бычьего сывороточного альбумина и 100 мг влажного веса отмытой биомассы клеток.

Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Добавляют 10 мкл 10%-ного глутарового альдегида с быстрым распределением его по поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при+4 С в течение 8 ч, после чего ферментный слой накрывают диализной мембраной, Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2—

7,4).

Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси. состоящей из

10 мкл биологического образца и 10 мкл 0,05

М раствора 0L- а-аланина.

10 Сенсорную часть электрода Кларка вводят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения©2, выраженной в нМ поглощенного Oz в 1 мин. Производят расчет концентрации молочной кислоты в образце согласно калибровочной кривой зависимости поглощения Oz при окислении

01 -лактата.

Пример.2, Культуру Aегоcoccus

viridans 167 VR (коллекция ВНИИА, М 1688) 20 выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 мкгlмл DL-лактата лития, 30 мкг/мл грамурина и 2 мкгlмл этония, буфером (рН 7,2 — 7,4) с центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин.

На мембрану перевернутого сенсорной частью вверх электрода наносят 5 мкл смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,8) и 1,5 мл 17,5%-ного бычьего сывороточного альбумина и 160 мл влажного веса отмытой биомассы клеток

35

Aегоcoccus vlridaris 167 VR (коллекция

ВНИИА, М 1688). Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Добавляют 1 мкл 10%-ного глутарового альдегида с быстрым распределением его по поверхности, мембраны стеклянной палочкой.

Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при+4 С в течение 8 ч, после чего ферментный слой накрывают диализной мембраной. Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 M фосфатный буфер (pH 7,2—

7,4).

Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из

10 мкл биологического образца и 10 мкл

0,1 М раствора О(- а-аланина. Сенсорную часть электрода Кларка вводят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения Oz, выражаемой в нМ поглощенного О2 в 1 мин. Производят расчет концентрации молочной кислоты в образце согласно калибровочной кривой

55 при 32 С течение 36 ч. Выросший налет

25 смывают 0,01 M фосфатным буфером (рН 7,2 — 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным

1655988

Таблица 1

Поглощение 0, нМ за 1 мин, при окислении разных изомеров лактата.Концентрация

: молочной кислоты> мкМ

Без добавок Алании 0>1 М Без доба Алании 0,1 М

Без добавок Алании О, 1 М

98,5-13>5

173 18

120-8

140.13, 1

220 10,8

253>21

105,6 17,3

171,3>23,2

110 11,2

201-23,2

231. 4,5

560-34,2

640>7 -!8»8

0,1 95,7i15>2

220 10,8

245,5 l8,2

555>5>25

613>8 12>8

155+7,2

180 15

0,5

20!! 17,8

191 11,2

476,2 2! 2

576-24

1,О

5>0

499,8 -1 1,2

591 >18, 8

317, 8 23

502,3-21,2

529,1 43>2

622,3 25

1О„О зависимости скорости поглощения 02 при окислении DL-лактата.

Пример 3. Культуру Aегоcoccus

viridans 167 VR(коллекция ВНИИА, 88 1688) выращивают на твердой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл О! -лактата лития, 30 мкг/мл грамурина и 2 мкг/мл этония при 32 С в течение 36 ч. Выросший налет смывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7;2 — 7,4), отмывают дважды 0,01 М фосфатным буфером (рН вЂ” 7,4) с центрифугированием при 3000 (76/мин в течение 15 м ин.

На мембрану перевернутого сенсорной частью вверх эле«трода наносят 5 мкл смеси, состоящей из 2,7 мл 0,1 M фосфатного буфера (рН 6,8) и 17 -ного бычьего сывороточного альбумина и 100 мл влажного веса отлитой биомассы клеток Аегососсцз

v}rtdans 167 VR. Смесь равномерно распределяют по поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Добавляют 10 мкл 10 (,-ного глутарового альдегида с быстрым распределением его на поверхности мембраны стеклянной палочкой.

Электрод инкубируют в перевернутом состоянии при+4 С втечение 8 ч, после чего ферментный слой накрывают диализной мембраной. Электрод помещают сенсорной частью в 0,01 M фосфатный буфер (рН 7,2—

7,4).

Для определения концентрации молочной кислоты в биологическом образце в микроячейку вносят 20 мкл смеси, состоящей из 10 мкл биологического образца и

10 мкл 0,15 M раствора 01 - а -аланина.

Сенсорную часть электрода Кларка вво5 дят в микроячейку и производят регистрацию скорости поглощения 02, выражаемой в нМ поглощенного 02 в 1 мин. Производят расчет концентрации молочной кислоты в образце согласно калибровочной кривой за10 висимости скорости поглощения 02 при окислении 1=лактата.

Время формирования сигнала составляет 2,9 — 4,1 с, время возвращения сигнала на базовый уровень при отмывке электрода

15 от метаболитов 3 — 5 с. Электрод может храниться до 2 мес при +4 С.

Формула изобретения

Способ определения молочной кисло20 ты, заключающийся в регистрации поглощения кислорода при окислении анализируемой смеси, содержащей молочную кислоту, иммобилизованным ферментным реагентом, о т л и ч à ю шийся тем, 25 что, с целью повышения чувствительности, в качестве ферментного реагента используют клетки Aегоcoccus uiridans ВНИИА, 1688, окисляющие D- и 1=изомеры молочной кислоты, а в анализируемую смесь добавля30 ют равный объем 0,05 — 0,15 M раствора DLа-аланина, 1655988

Таблиц а 2

1 !

Поглощение 0, нМ за 1 мин,. при окислении DL-лактата при введении в систему DL-о(-аланина в концентрации, И

Концентрации молочной кислоты, мкИ

0, 15

0,1

145 7,5

210,8 11,2

223,5 9,5

0,5

1,0

499,8 11,2

591+18, 8

499,9 20,7

593 20,3

317,8 23

502,3 21,2

5,0

10,0

У О

Составитель А. Семенов

Редактор Т. Лазаренко Техред M.Mîðãåíòàë Корректор С. Шевкун

Заказ 2030 Тираж 371 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

98, 5 13,5

173 18

201 17,8

125 10,2

193,2+ 8, 7

210-2,5

340,8 5,6

531 12 7

140-13, 1

220 10,8

253 21