Способ идентификации ингибиторов гидролаз

 

Изобретение относится к энзимологии и биотехнологии и может использоваться в биохимии растений и животных, в частности в работах по биохимии иммунитета растений к вредным организмам, а также в медицинской биохимии для идентификации ингибиторов индивидуальных компонентов сложных смесей гидролаз. Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности способа идентификации ингибиторов отдельных компонентов смесей гидролаз. На пластины гелей наносят препараты, содержащие ингибиторы и гидролазы, и проводят их раздельное фракционирование электрофорезом, изофокусированием или другими методами, после чего обеспечивают условия для перекрестного взаимодействия компонентов спектров ингибиторов и гидролаз. Для этого накладывают один гель на другой или последовательно снимают реплики с гелей таким образом, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаз пересекались под прямым углом. В результате диффузии компонентов из геля в гель происходит их пространственное совмещение в точках пересечения. Это делает возможным биохимическое взаимодействие компонентов ингибиторов и гидролаз. В гелях или репликах выявляют компоненты гидролаз по активности. В точках пересечения компонентов гидролаэы с их специфичными ингибиторами полосы ферментов сужаются или прерываются. 2 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 0 1/40

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4692980/13 (22) 22.05.89 (46) 15.05.91. Бюл. М 18 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений (72) А.В. Конарев, Ю.В. Фомичева и

Н.А. Вилкова (53) 577.157(088. 8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1175967, кл. С 12 0 1/40, 1985. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ГИДРОЛАЗ (57) Изобретение относится к энзимологии и биотехнологии и может использоваться в биохимии растений и животных, в частности в работах по биохимии иммунитета расте- ний к вредным организмам, а также в медицинской биохимии для идентификации ингибиторов индивидуальных компонентов сложных смесей гидролаз. Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности способа

Изобретение относится к знэимологии и биотехнологии и может быть использовано в биохимии растений.и животных, в частности в работах по биохимии иммунитета растений к вредным организмам, а также в медицинской биохимии для идентификации ингибиторов индивидуальных компонентов сложных смесей гидролаз.

Цель изобретения — упрощение и повышение разрешающей способности способа идентификации ингибмторов отдельных компонентов смесей гидралаэ..... Ж „, 1648979 А1 идентификации ингибиторов отдельных компонентов смесей гидролаз. На пластины гелей наносят препараты, содержащие ингибиторы и гидролазы, и проводят их раздельное фра кционирование зле ктрофоре зом, изофокусированием или другими методами, после чего обеспечивают условия для перекрестного взаимодействия компонентов спектров ингибиторов и гидролаз. Для этого накладывают один гель на другой или последовательно снимают реплики с гелей таким образом, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаэ пересекались под прямым углом.

В результате диффузии компонентов иэ геля в гель происходит их пространственное совмещение в точках пересечения, Это делает возможным биохимическое взаимодействие компонентов ингибиторов и гидролаз. В гелях или репликах выявляют компоненты гидролаз по активности. В точках пересечения компонентов гидролаэы с их специфичными ингибиторами полосы ферментов сужаются или прерываются. 2 з.п. ф-лы.

fl р и м е р 1. Идентификация белков зерна пшеницы — ингибиторов компонентов а -амилаз насекомых.

Белки-ингибиторы извлекают из 1 г муки пшеницы 2-кратным обьемом воды в течение I ч, Смесь центрифугируют, прогревают надосадочную жидкость 10 мин при 800С для инактивации P - амилаэ и вновь центрифугируют, осадок отбрасывают. а - Амилаэы извлекают, гомогенизируя личинки зернового точильщика

1648979

-амилаз зернового точильщика ингибируются сходными компонентами белков зерна пшеницы.

Пример 2, Идентификация ингибиторов компонентов а-амилазы прорастающего зерна пшеницы.

Фракцию белков, содержащую ингибиторы, экстрагируют из 10 r муки пшеницы

2-кратным обьемом воды, После центрифугирования методом аффинной хроматографии на субтилизин-сефарозе очищают бифункциональные ингибиторы а -амилазы/субтилизина. а -Амилазы зкстрагируют

5-кратным объемом 0,1 -ного СаО2 из про- 40 раставших в течение 3 дней при 22 С и затем высушенных и размолотых зерен пшеницы, Экстракт прогревают 5 мин при

71 С для инактивации а -амилаэ.

Полимеризуют два 6 ПААГ, содержащих 2 $ амфолин, рН 5 — 8, для фракционирования ингибиторов и 2 сервалитов, рН

3-10, для а -амилаз. Гель для а -амилаз полимеризуют на подложке.

Ингибиторы (200 мкг/мл) наносят с помощью бумажной полоски 5х80 мм, которую накладывают на гель в 20 мм от анода параллельно электродным полоскам.

Раствор а -амилазы разбавляют в 5 раэ и наносят полоской 10х80 мм в 50 мм от анода. После изофокусирования часть геля на подложке со спектром а- амилаз выреRfiyzopertha dominica F, с 4-кратным объемом 0,1 -ного СаС!2.

Полимеризуют два 6 (, ПААГ, толщиной

0,2 мм, содержащие 2 (, амфолин, рН 5-8 для ингибиторов. и 2ь сервалитов, рН 3-7 для Q -амилаз, Ингибиторы и а -амилазы наносят на гели с помощью полосок фильтровальной бумаги 10х100 мм. Проводят изофокусирование на приборе при расстоянии между электродами 100 мм. Готовят 6 (, ПААГ-реплику толщиной 0,2 мм на подложке, содержащей 0,1 М Na-ацетатный буфер, рН 5, и

0,4-ный крахмал. После изофокусирования реплику накладывают на гель с ингибиторами на 10 мин, затем ее переносят на гель с а -амилазами так, чтобы компоненты белков-ингибиторов и а -амилаз пересекались под прямым углом, и инкубируют 30 мин при

37 С. Репами ку помещают в раствор иода (1 г32 и 5 г К3 на 1 л воды). Компоненты Q -амилаз проявляются в виде прозрачных полос на синем фоне. В зонах пересечения компонентов а --амилаз и их ингибиторов линии а-амилаэ сужаются или прерываются. Все основные компоненты а5

25 зают и накладывают на гель, на котором разделялись ингибиторы, так, чтобы угол между линиями компонентов белков и а -амилаз составлял 90О. Через 30 мин гели разъединяют и на них накладывают эаполимеризованные на подложке гели-реплики, содержащие 0,1 M йаН2РО4 и 0,4 -ный крахмал, и инкубируют при 37 С 30 мин.

Реплики погружают в раствор иода. В зонах пересечения со специфичным компонентом ингибиторов компоненты a - амилаз прерываются, Формула изобретения

1. Способ идентификации ингибиторов гидролаэ, включающий раздельную экстракцию гидролаэ и их ингибиторов из исходного сырья, фракционирование ингибиторов гидролаз в пластинах геля, пространственное совмещение геля, содержащего спектр ингибиторов гидролаз, с гелем, содержащим ферменты класса гидролаз, в присутствии субстрата реакции, с последующим определением активности гидролаз в зонах их пересечения с ингибиторами и идентификацией ингибиторов гидролаз по активности гидролаз, о т л и ч а юшийся тем, что. с целью упрощения и повышения разрешающей способности способа, полученный экстракт гидролаз непосредственно фракционируют в пластинах геля и полученные пластины, содержащие спектр гидролаэ, используют для пространственного совмещения с гелем, содержащим спектр ингибиторов гидролаз.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что совмещение спектров ингибиторов и гидролаз осуществляют путем наложения геля, содержащего спектр ингибиторов, на гель, содержащий спектр гидролаз, так, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаз пересекались под прямым углом, затем пластины гелей разъединяют и на каждый из них накладывают гель, содержащий субстрат реакции, 3. Способпоп.1, отличающийся тем, что совмещение спектров ингибиторов и гидролаз осуществляют путем последовательного наложения геля, содержащего субстрат реакции, на гель, содержащий ингибиторы, и затем на гель, содержащий гидролазы, так, чтобы компоненты ингибиторов и гидролаэ в геле, содержащем субстрат реакции, пересекались под прямым углом.