3-аминопропилгликозиды дисахаридов в качестве лигандов иммуносорбентов для связывания группоспецифических антител анти-а и анти-в

 

Изобретение касается замещенных гликозидов дисахаридов, в частности (3-аминопропил)-3-0-(2-ацетамидо-2-дезокси-α-D-галактопиранозил)-β-D-галактопиранозида или (3-аминопропил)-3-0-(α-D-галактопиранозил)-β-D-галактопиранозида в качестве лигандов иммуносорбентов для связывания групп специфических антител анти-А и анти-В, и может быть использовано в биохимии. Цель - создание новых более доступных и удобных для иммобилизации олигосахаридных лигандов. Синтез ведут, например, реакцией 1,2-ди-о-ацетил-3,4,6-0-бензил-D-галактопиранозы с 3-трифторацетамидопропанолом в среде CH<SB POS="POST">2</SB>CL<SB POS="POST">2</SB> в присутствии эфирата BF<SB POS="POST">3</SB> при 0°С с последующим выделением промежуточного продукта, его гидргенозилом на 10%-ном PD/C при 20°С, упариванием отфильтрованного продукта, растворением в ацетонитриле и добавлением диметилацеталя бензальдегида, 4-толуолсульфокислоты и затем пиридина. Выделенный хроматографически продукт растворяют в CH<SB POS="POST">2</SB>CL<SB POS="POST">2</SB>, добавляют молекулярные сита, карбонат серебра и перхлорат серебра и затем 2-азидо-3,4,6-три-о-ацетил-2-дезокси-β-D-галактопиранозилхлорид в растворе CH<SB POS="POST">2</SB>CL<SB POS="POST">2</SB>. Выденный хроматографически дисахарид растворяют в уксусной кислоте, выдерживают 2 ч при 70°С, упаривают, добавляют уксусный ангидрид и проводят гидрогенолиз на 5%-ном PD/C в среде метанола. Выделяют целевой продукт также хроматографически. Сорбция на уровне известной. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„161 2 (51) 5 С 07 Н 15/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕИНЫЙ КОМИТЕТ

ДО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

APH ГКНТ СССР (21) 4371036/30-04 (22) 09.02.88 (46) 30. i? .90. Бюл. P.- 48 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) Е.В.Корчагина и Н.В.Бовин (53) 547.917 (088.8) (56) Патент США М 4195174, кл. 536-18, 1980.

Патент США Nl 4238473,. кл. 424-11, 1980.

Патент США Р 4137401, кл. 536-116, 1979. (54) 3-АИИНОПРОПИЛГЛИКОЗИДЫ ДИСАХАРИДОВ В КАЧЕСТВЕ ЛИГАНДОВ ИИМУНОСОРБЕНТОВ ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКК(АНТИТЕЛ АНТИ-А и АНТИ-В (57) Изобретение касается замещенных гликозидов дисахаридов, в частности (3-аминопр опил) -3-0- (2-а цетамид о-2дезокси-ф;0-галактопиранозил)-|%-Эгалактопиранозида или (3-аминопропил ) -3-0- (g-D-гала кт опир а но зил) -P-Dгалактопиранозида в качестве лиганl дов иммуносорбентов для связывания групп специфических антител анти-А и анти-В, и может быть использовано в

Изобретение относится к химии дисахаридов, обладающих биологической активностью, проявляющих свойства группоспецифических антиг енных детерминант групп крови А и В, а именно к

3-аминопропилгликозидам дисахаридов общей формулы

2 биохимии. Цель изобретения — создание новых, более доступных и удобных для иммобилизации олигосахаридных лигандов. Синтез ведут, например, реакцией 1, 2-ди-0-ацетил-3,4,6-0-бензилD-галактопиранозы с 3-трифторацетамидопропанолом в среде СН С1 в присутствии эфирата BF при О С с последующим выделением промежуточного продукта, его гицргенолизом на 10%-ном о

Pd/Ñ при 20 С, упариванием отфильтрованного продукта, растворением в ацеToHHTpHJIB и добавлением диметилацеталя бензальдегида, 4-толуапсульфокислоты и затем пиридина. Выделенный хроматографически продукт растворяют в СН Clz, добавляют молекулярные сита, карбонат серебра и перхлорат серебра и затем 2-азидо-3,4,6-три-Оа цетил-2-д ез окси-)-0-гала кт опира нозилхлорид в растворе СН Clz. Выделенный хроматографически дйсахарид растворяют в уксусной кислоте, выдерживают 2 ч при 70 С, упаривают, добавляют уксусный ангидрид и проводят гидрогенолиз на 5%-ном Pd/Ñ в среде метанола. Выделяют целевой продукт также хроматографически. Сорбция на уровне известной. 1 табл. !

СН СБ (И ОН.

Ho)-o Ho о0(сн,)нн, ,ОН), 0

Я GE

16169 24 где R — NHCOCH, OH, в качестве лигандов иммуносорбентов для связывания группоспецифических а нтит ел а нти-А и а нти-В и кот орые

9 5 мо ут быть использованы в медицине.

Цель изобретения — новые пр ои з водные дисахаридов, проявляющие свойства группоспецифических антигенных детерминант групп крови А и В, которые, . не уступая по свойствам известным ана-! .логам — трисахаридам, являются более доступными и удобными для иммобилизации олигосахаридного лиганда" для получения иммуносорбента для связывания анти-А и анти-В антител .

Поставленная цель достигается предлага емьгьги 3-аминопропилгликозидамн дисахаридов общей формулы I.

Пример 1. Получение (3-ами- 20 нопр опил ) -3-0- { 2-а цетамид о-2-де з оксиМ-D-гаиактопираноаип)- -D-гапактопиранозида (Ia) .

К смеси 3 г (5,6 ммоль) 1,2-ди-Оацетил-3,4,6-три-0-6ензил-D-галакто- 25 пиранозы (II), 1,5 мл (10 ммоль) 3трифторацетамидопропанола и 30 мп

СН С1 при 0 С прибавляют за 10 мнн

3 мп (24 ммоль) эфирата трехфтористого бора. Выдерживают смесь 1 ч при

0 С, 2 ч при 20 C затем разбавляют о хлор оформом, промывают, выделяют к олоночной хроматографией (КХ, здесь и далее на силикагеле). Получают 2,8 г (78 ) (3-трифторацетамидопронил) -2-035 а цетил-3, 4, 6-три-О-б ензил-Р-0-гала ктопиранозида (III) сироп.

ПМР (СПС13): 1,80 м (2Н, ССН с);

2902 С (ЗН, Ас); 4,43 д (1Н, Jr,g 8Гц, H-1); 7,22 (1Н, NH); 7,3 — 7,4 м (15Н, 3Ph) .

1,8 г (6 ммоль) соединения I .растворяют в 100 мп метанола и проводят гидрогенолиз над 0,8 r 10 Pd/Ñ при

20ОС в течение 24 ч. Катализатор отделяют, раствор упаривают, остаток растворяют в 40 мп ацетонитрила, прибавляют 10 мг 4-толуолсульфокислоты и 1,1 мп (7 ммоль) диметилацеталя бензальдегида. Через 1 ч прибавляют

1 мп пиридина, упаривают, после КХ и перекристаллиэации из смеси хлороформ-гексан получают 0,88 r (68 ) (3-трифт ора цетамид опр опил ) -2-0-а цетил-4 6-О-бенэилиден-1г -0-галактопира55

9 о нозида (IV) т.пл. 176-178 С.

ПИР (CDCI>): 1,80 м (2Н, ССН С);

2,08 с (ЗН, Ас); 4,41 д (1Н, J,g

8 Гц, Н-1); 5, 50 с (1Н, PhCH); 7, 10 (1Н, ИН); 7,3-7,4 гл (5H, Ph7.

Найдено 9 - С 51, 70, Н > 9 68 9

N 2,99.

С 20 Н24 NF305

Вычисленор %: С 51, 84; Н 5,22;

N 3,02.

230 мг (095 ммоль) соединения (IV) растворяют в 40 мл CH Cl „прибавляют

S г молекулярных сит 4А., 2,5 г карбоната серебра и 70 мг перхлората серебра, затем 350 мг (1 ммоль) 2-азидо-3,4 „6-три-0-ацетил-2-дезокск-Р-0галактопиранозилхлорида в 20 мл СН С1 .

Через 1 ч смесь разбавляют хлсроформом, фильтруют, промывают. После КХ вьделягат 300 мг (77 ) дисахарида (V), т.пл. 101-102 С (этилацетат-эфир-rексан) .

ПМР (СПС1 ): 1,65 и (2Н, ССН C), 196 с, 198 с, 201 с, 206 с (12Н, 4Ас), 4,42 д (1Н, J z 8 Гц, Н-i) ;

5,1 д (1Н, 1,,г 4 Гц, Н-1 ), 5,52 с (i H, PhCH); 7,06 { iH, 1 Н); 7,3-7,5 (5Н, Ph) .

Найдено, .: С 49,20, Н S,24.

С, H»N„F,Ог .

Вычислено, %: С 49,49*, Н 5,06.

80 мг (0,1 ммоль) дисахарнда V растворяют в 20 мл 70 -ной уксусной кислоты и выдерживают при 70ОС 2 ч.

Упаривают„остаток растворяют в 10 мп метанола, прибавляют 0,4 мл уксусного ангидрида и 80 мг 5 Pd/Ñ, проводят гидрогенолиз при 20 С в течение

18 ч. Фильтруют, упаривают, остаток растворяют в 20 мл метанола, прибавляют 0,03 гл 0,1 N метилата натрия в метаноле, через 12 ч упаривают, после

КХ вьделяют 20 мг (34%) дисахарида с защищенной аминопропильной группой.

IINP (DNCO-d ): 1,65 м (2Н, ССН С)"9

1,80 с„1,99 с (6Н, 2Ас), 4,33 д (iH, J <,г 8 Гц, Н-1), 4,67 д (1H, Л» gr

4 Гц, Н-1 ); 7,49 д (1Н, J 9 Гц, NHAc), 9, 33 (1 Н, NHCOCFg)

Полученный дисахарид растворяют в смеси 2 мл этанола и 2 мл воды, прибавляют 40 мг анионита в ОН-форме и перемешивают 16 ч, получают свободный дисахарид (Та) 9 выход 14,5 мг (100 ) .

Rf 0,3 (ТСХ, этанол — трет-бутанол вода — пиридин — уксусная кислота, 5:131:1го 3), PoLJQ + 98,4 (С 0,5, 80,этанол) . и 1Р (Э О): 1,8 м (2Н, ССН С), 1,95 с (ЗН, NHAc}, 4,3 д (1Н, Л =24 6

:1:1:0,3). (gg» + 107,6 (С 0,5, 807 спирт) .

ПМР (Р О): 1,9 м (2Н, CCH С), 44 (1Н, J = 8 Гц, Н1), 5,2 д (1Й, J4 Гц, H1 ).

Синтезированные дисахариды Ia и Хб используются для получения иммуносороентов для сорбции соответствующих группоспецифических антител анти-А и анти-В из сыворотки крови человека.

Пример 3. Получение иммунос орбента.

Соединения Ia или Тб растворяют в

2-3 мл N N-диметилформамида, прибавляют 1 г макропористого стекла (МПС), активированного поли(п-нитрофенилакрилатом), оставляют на 1 сут, периодически перемешивая суспензию, Полноту привязки контролируют ТСХ по исчезновению нингидрин-положительного пятна лигандов Ia или Тб. Полученный сорбент промывают на фильтре N,N-диметилформамидом, эфир ом, сушат.

Сорбенты, содержащие ?,5 и .

15 мкмоль лиганда на 1 r МПС, получают аналогично °

Изучение сорбции.

50 мг сорбента промывают водой, фосфатно-солевым буферным раствором, инкубируют при 4 С с 0,5 мп сыворота ки крови доноров исследуемой группы крови (группы крови А — дл.". сорбента, содержащего лиганд Ia,  — для сорбента, содержащего лиганд Тб) в течение 3 ч. Титр антител определяют до и после сорбции методом солевой агглютинации.

Результаты приведены в таблице.

Таким образом, в качестве лигандов иммуносорбентов для связывания анти-А и анти-В антител предложены спейсерированные дисахариды Ia и Тб» сорбционная способность полученных на их основе сорбентов не уступает таковой сорбентов, включающих триса-. харидный лиганд .

Синтез новых дисахаридных лигандов значительно проще и короче синтеза трисахаридных лигандов.

Свободная аминогруппа в спейсерной части предлагаемых лигандов Ia и Тб позволяет просто и количественно иммобилизовать их на активированном поли(п-нитрофенилакрилатом) твердом носителе.

16 169

=8Гц, Н1 ),. 4,72 д (1Н, J = 4 Гц, EI1) .

Пример 2. Получение (3-аминопропил) -3-0-(o4 — D-гала ктопиранозил)—

-D-ãàëàêòoïèð анозида (I6), S

300 мг (0,65 ммоль) соединения (IV) растворяют в 30 мп бензола, прибавляют 3 г молекулярных сит 4А и 1 8 г (7 ммоль) цианида ртути, затем при перемешивании за 20 мин раствор

620 мг (1 ммоль) 2,3,4,6-тетра-0бензил-0 -0-галактопиранозилбромида в

5 мп бензола . Через 72 ч разбавляют

200 мл хлороформа, фильтруют, промы- 15 вают, после КХ выделяют 420 мг (60%) дисахарида (VI), т.пл. 92-93ОС (ацетон — эфир — -. åêñà í) .

ПМР (CDClg): 1,85 м (2Н, ССН С)»

2,00 с (ЗН, Ac)» 4,40 д (1H, J gg

8 Гц» Н 1) » 5»11 д (1Н» JÄ 3 ° 5 Гц»

Н-1 ), 5,28 с (1Н, Ph СН); 7,2-7,4 м (25Н, 5Ph) .

Найдено, 7: С 65,50, Н 5,90,"

N1 53 25

С МН6Ь Р ЗО 13 °

Вычислено, 7.: С 65,72, Н 5,93 ф 1,42.

200 мг (0,2 ммоль) дисахарида (VI) растворяют в 10 мл метанола и добав- 30 ляют 0,1 мл 1 М раствора метилата натрия в метаноле. После снятия ацетильных групп (контроль по ТСХ) нейтрализуют смолой 1R-120 (Н ), фильтруют и упаривают. Остаток растворяют в 35

5 мл 607-ной уксусной кислоты и выдерживают при 70-75ОС в. течение 5 ч, упаривают досуха, выделяют КХ тетра0-бензильное производное, которое растворяют в 20 мл метанола и прибав- 40 ляют 80 мг 107 Pd/C, гидрогенолиз проводят 24 ч при 20 С.

Катализатор отфильтровывают, раствор упаривают и лиофилизуют из воды, получают 60 мг (607) аморфного диса- 45 харида с защищенной аминопропильной группой (VII).

ПМР (D<0); 1,90 м (2Н, ССН С),4,45 д (1FI, Х д 8 Гц, Н-1), 5,22 д (1Н, .т, > 4 Гц, Í-1 ). 50

Полученный дисахарид (20 г) растворяют в 6 мл смеси этанол — вода

1:1, прибавляют смолу в ОН-форме и перемешивают в течение 24 ч. Раствор фильтруют, упаривают, лиофилизуют из воды, выход свободного дисахарида Тб

15,4 мг (100%).

Rf О, 2 (ТСХ, этанол: трет-бутанол:

: вода:пиридин:уксусная кислота, 5: 1:

Фор мула и зобр ет ения

3-Аминопропилгликозиды дисахаридов общей формулы он,он ha он

БО оо(он,)кн, 5

1616924 где R — NHCOCHÝ9 ОН, в качестве лигандов иммуносорбентов для связывания группоспецифических

5 антител анти-А и анти-В.

Титр сыворотки

Сорбент до сорбции после. сорбции

ЗУпзогЬ А и Synsorb  — коммерческие образцы фирмы Chembiomed (Канада)

11

Данных о количестве лиганда на 1 r МПС фирма не приводит. Из данных проИ 1 тотипа количество лиганда на 1 r МПС 2-6 мкмол/г.

В - сорбент, содержащий в качестве лиганда дисахарид ТХб, А — дисахарид Та.

Составитель Н.Нарышкова

Редактор Н. Кишгулинец Техр ед N.Ìoðãeíòàë

Корректор М.Самборская

Заказ 4094 Тираж 293 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Synsorb В

В

Syns orb В

ВИММ

В

Synsorb A

А4.МФ

А

Synsorb А

A >+

А

Synsorb А

А

А олич ест во иганда на г МПС, кмоль

7,5

2

7,5

2

1,5

1 5

*A

7,5

15 AA

7.,5

1.»

Групп крови сыворотки

А

А

А

В

В

В

В

В

В

В

В

В

1:64

1:64

1:64

1:64

1:64

1:64

1:64

1:64

1: 128

1: 128

1:128

1: 128

1:64

1:64

1:64

1:64

1:32

1:32

1:32

1:32

1:16

1:16

1:8

1:4

1:16

1:16

1:8

° 4

1:32

1:32

1:16

1:16

1! 16

1:8

1:4

1:4

1:4

1:2

1:2

1:2

Снижение титра, на ступени

2

2

3