Способ выявления функционирующих капилляров

 

Способ выявления функционирующих капилляров относится к области медицины, а именно к нормальной и патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и может быть использовано для функциональной характеристики терминального звена микроциркуляторного русла в нормальных и патологических условиях. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа. Цель достигается тем, что процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей осуществляется одновременно в смеси, состоящей из 40%-ного раствора формальдегида и абсолютного (100°) этилового спирта в соотношении 1:9, при температуре -20°С в течение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной температуре в течение оставшихся 2 сут. Способ технически легко воспроизводим, позволяет в более короткие сроки с меньшим набором реактивов и оборудования изучить функциональное состояние внутриорганного капиллярного русла, осуществить контроль за действием различных вазоактивных препаратов на микроциркуляторную систему в условиях нормы и патологии, а также выявить локализацию и определить размеры очагов ишемии при моделировании ряда сосудистых заболеваний.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)я А 6 . В 10/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ .

ПО ИЗОБРЕТFНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4337918/30- ": 4 (22) 28.10.87 (46) 30.12.90. Бюл. ¹ 48 (71) Казанский государственный институт усовершенствования врачей им. В.И. Ленина (72) В.Г. Малышев (53) 615.475(088,8) (56) Долежел С., й! ендеров С.M. Усовершенствованный гистологический метод выявления открытых капилляров. Бюллетень экспсриментальной биологии, 1977, ¹ 9, с. 377-379. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ КАПИЛЛЯРОВ (57) Способ выявления функционирующих капилляров относится к области медицины, а именно к нормальной и патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и может быть использован для функциональной характеристики терминального звена микроциркуляторного русла в норИзобретение относится к медицине, а именно к нормальной патологической физиологии сердечно-сосудистой системы, и может быть использовано для функциональной характеристики терминального звена микроциркуляторного русла в нормальных и патологических условиях.

Цель изобретения — ускорение и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей осуществляют одновременно в смеси, состоящей из 40%-ного раствора фор- . мальдегида и абсолютного (100 ) этилового спирта в соотношении 1:9, при — 200С в те„„ U „„, 1616616 Al мальных и патологических условиях. Цель изобретения — ускорение и упоощение спосооа. Цель достигается тем, что процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей ссущес.:-вляется одновременно в смеси, состоящей из 40%-ного раствора формальдегида и абсолютного (100O) этилового спирта в соотношении 1:9, при температуре -20 С в течение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной температуре в течение сставшихся 2 сут. Способ технически легко воспроизводим, позволяет в более короткие сроки с меньшим набором реактивов и оборудования изучить функциональное состояние внутриорганного капиллярного русла. осуществить контроль за действием различных вазоактивных препаратов на микроциркуляторную систему в условиях нормы и патологии, а также выявить локализацию и определить размеры очагов ишемии при моделировании ряда сосудистых заболеваний. чение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной температуре в течение оставшихся двух суток, Способ осуществляют следующим образом, Крупных лабораторных животных (например: кролик, кошка, собака) наркотизируют гексе налом (15 — 20 мг/кг, внутрибрюшинно). Извлекают исследуемый орган, край или часть которого можно выделить без нарушения его кровоснабжения (например: печень, селезенка, желудочнокишечный тракт и т.д.). Под необходимый участок органа подкладывают кусочек фоль1616610 ги. Через 10-20 мин "отдыха" орган заливают переохлажденным пропанбутаном (в дальнейшем — пропан). Для этого открывают вентиль баллона с пропаном и позволя° ют ему в количестве 100-150 мл свободно вытекать в сосуд Дьюара, на дно которого предварительно кладут небольшой кусочек сухого льда. Затем пропан охлаждают, погружая его в медном стакане в жидкий азот, Проморозку органов у мелких лабораторных животных, таких как мышь, крыса, морская свинка, хомяк и т,д. (предварительно наркотизированных гексеналом в той же дозировке) осуществляют путем опускания тушки в стакан с переохлажденным пропаном. Таким же способом производится глубокое охлаждение ткани головного мозга (доступ к которой в прижизненных условиях невозможен без нарушения регионарного кровенаполнения) с последующим быстрым вскрытием черепной коробки.

Затем из замороженного органа выдалбливают пластинки ткани толщиной 3 — 5 мм с помощью долота, охлажденного в сосуде с сухим льдом, Выделенный замороженный блок быстро переносят в смесь, состоящую из 40%-ного раствора формальдегида и абсолютного (100 ) этилового спирта в соотношении 1. 9, предварительно охлажденную до — 20 С в морозильной камере бытового холодильника. Срок инкубации блоков при данной температуре — 4 ч. После этого сосуд с фиксирующими блоками вынимают из холодильника, и дальнейшая инкубация ткани в формалин-этанольной смеси (ФЭС) осуществляется при комнатной температуре.

Спустя 6-8 ч от начала инкубации ФЭС необходимо обновить, Полный период инкубации блоков составляет 48 ч. Необходимо помнить, что объем инкубирующей жидкости должен постоянно превышать объем . всех взятых блоков не менее чем в 20 раз.

После окончания инкубации блоков в.

ФЭС их сразу же пропитывают парафином в условиях пониженного атмосферного давления (достаточно водоструйного насоса), Процесс парафинизации ткани длится 8—

10 мин. Из парафинизированных блоков на обычном микротоме изготавливают срезы толщиной 20 мкм, для расправления их переносят в дистиллированную воду и приклеивают на предметное стекло с помощью белка, приготовленного по Майеру. Затем препараты высушивают и депарафинизируют (ксилол, абсолютный этиловый спирт и

70 -ный этиловый спирт), После смачивания срезов дистиллированной водой проводят бензидиновую реакцию по Пикворсу. В начале препараты инкубируют в растворе ¹ 1 в течение 5 мин.

40 вым наркозом (15 мг/кг, внутрибрюшинно) произведен срединный нижне-шейный кожный разрез. После выделения проксимального сегмента обеих подключичных артерий отыскивали устье позвоночных артерий, расположенное дистальнее места отхождения каротид. Проксимальный участок обеих позвоночных артерий брали на лигатуру и перевязывали. Кожную рану послойно ушивали наглухо.

За несколько минут до опыта приготавливали. переохлажденный пропанбутан (в дальнейшем — пропан). Для этого брали баллон с пропаном, открывали вентиль и позволяли пропану в количестве 100-150 мл свободно вытекать в сосуд Дьюара, на дно которого предварительно помещали небольшой кусочек сухого льда, Пропан охлаждали, погружая его в медном стакане в жидкий азот.

Для его приготовления берут 0,5 г бензидина-основание и растворяют в 50,0 мл 96 -ного этилового спирта. 0,1 r нитропруссида натрия растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды. Оба раствора смешивают и доводят дистиллированной водой до

100,0 мл. Раствор нитропруссида натрия не стоек, поэтому его готовят перед употреблением. Признак порчи этого раствора — появление зеленовато-голубоватой окраски после прибавления раствора бензидина. В последующем среды быстро споласкивают дистиллированной водой и перекладывают в раствор ¹ 2 на 3 мин. Для его приготовления берут 50,0 мл 96 этилового спирта, куда прибавляют 2,0 мл ледяной уксусной кислоты и 0,5 мл пергидроля, 0,1 г нитропруссида натрия растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды. Оба раствора смешивают и доводят дистиллированной водой до 100,0 мл, После окончания инкубации препараты споласкивают дистиллированной водой не менее 10 мин и высушивают электрическим вентилятором, Конечный этап способа состоит из последовательного обезвоживания (в 96 -ном этиловом спирте), просветления (в ксилоле) и заключения препаратов в бальзам. Предпочтительно хранить готовые препараты в темноте, поскольку на свету они со временем выцветают.

Внутрисосудистые эритроциты, обработанные с помощью бензидина, окрашиваются в черный цвет, поэтому функционально-активные капилляры хорошо контрастируют на бесцветном или слегка зеленовато-голубоватом фоне среза.

Пример 1. Белой беспородной крысе — самцу массой 135-r под гексенало1616610

Через 6 ч после операции наркотизированное гексеналом (в той же дозировке) животное опускалось в стакан с переохлажденным пропаном и затем быстро вскрывалась черепная коробка. С помощью микродолота, охлажденного в сосуде с сухим льдом, из замороженного головного мозга выдалбливали продолговатый мозг, варолиев мост, гипоталамус и большие полушария (задний отдел) толщиной не более

3-5 мм. Выделенный замороженный блок быстро и реносили в смесь, состоящую из

40 -ного раствора формальдегида и абсолютного (100О) этилового спирта в соотношении 1:9, предварительно охлажденную до -20 С в морозильной камере бытового холодильника. Срок инкубации блоков при данной температуре 4 ч.

Способ будет с успехом применен для . выявления функциониоующих капилляров практически в любых органах экспериментальных животных. Он позволяет, с достаточной долей информативности, не только качественно, но и количественно оценить функциональное состояние терминального отдела микроциркулятарного русла в момент остановки кровотока, т.е. в прижизненных условиях. Для количественной характеристики эритроцит-содержащих капилляров использовали окуляр-микрометр и микрометрическую сетку, встроенные в обычный световой микроскоп, Общепринятыми методами измеряли плотность п, длину I, мкм, и диаметр d, мкм, капилляров в

1 мм препарата. Полученные показатели использовали для вычисления с2аедней площади поверхности M=rddn, мкм /мм1, среднего обьема V = @ d In, в мкм /мм, 2 з з

2 поперечного сечения S = d n, мкм /мм, =4 капилляров-параметров, характеризующих уровень регионарного кровенаполнения и транскапиллярный обмен. Все это имеет большое диагностическое значение при изучении закономерностей внутриорганного локального кровоснабжения в условиях нормы, действия различных экстремальных (стрессовых) факторов, при моделировании ряда сосудистых заболеваний (гипертониче. ская болезнь, атеросклероз, различные окклюзии, аномали, травма и т.д,), в процессе испытания вазоактивных фармакологических препаратов.

Опыт выявления функционирующих капилляров предлагаемым способом показал, чта необходимо постоянно контролировать качество приготовления препаратов. Для этого желательно проводить параллельную обработку гистологического материала ат опытных (например 5 — 6) и контрольных (например 2 — 3) животных. Если срезы, полученные от контрольных животных, будут отличаться от тех, которые были обработаны

5 ранее(например появление экстравазатов— признака деструкции капилляров, выраженного зеленовато-голубоватого фона, отсутствие капиллярнога рисунка или его недостаточное контрастиравание), то мате10 риал, полученный от опытных животных и обработанный в тех же условиях, не анализировался и уничтожался. После этого последовательна проверялась вся цепочка этапов метода и находилась причина, cno t5 сабствующая появлению того или иного методического артефакта (возможное неравильное приготовление и хранение реактивов, нарушение режима и сроков фиксации препаратов и т.д.), которая немедленно

20 устранялась. Затем на 2 — 3 контрольных животных проводился контроль воспроизводимости метода и если результаты не расходились с полученными ранее, то запускалась опытная серия животных (при абя25 эатеflьíîM паpàëëåëüíîM контроле), Необходимо отметить, что при правильном выполнении способа все причины, веду цие к методическим артефактам, как правило, беэ труда выявляются и устраняются.

30 Таким образом, предлагаемый способ выявления функциснирующих капилляров технически легко воспроизводим, не требует дорогостоящей аппаратуры, уменьшает количества используемых реактивов, осу35 ществляется в более короткие сроки без

/худшения качества выявляемых гистологических структур. Одновременно он высокоинформативный и доступный в .работе экспериментальной лаборатории различ40 ного профиля, способствует ускорению выполнения профильных научно-исследовательских работ.

Формула изобретения

Способ выявления функционирующих

45 капилляров, включающий глубокое замораживание органа, обезвоживание, фиксацию, парафинизацию блоков, резку их на микратоме, депарафинизацию срезов, окраску по Пикворсу, обезвоживание, прасвет50 ление и заключение в бальзам, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, процесс обезвоживания и фиксации блоков тканей осуществляют одновременно в смеси, состоящей иэ

55 40 -ного раствора формальдегида и абсолютного этилового спирта в соотношении

1:9, при температуре — 20 С в течение первых 4 ч с последующей инкубацией блоков в двух порциях этой смеси при комнатной темпэоатуре в течение последующих двух суток.