Способ определения стероидов в насекомых

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к методам разработки питательных сред для массового разведения насекомых, используемых для биометода. Цель - повышение эффективности за счет ускорения процесса. Новый способ включает экстракцию пробы насекомого смесью растворителей: флороформ - метанол или хлористый метилен-метанол (2:1), обработку экстракта водой, а после расслоения фаз выделение целевых фракций методом твердофазной экстракции. Выделение экдистероидов из верхней фазы производят путем твердофазной экстракции на силикагеле с химически привитыми октадецилсилановыми группами последовательной обработкой экстрагента водой, 25 и 50%-ным раствором метанола в воде. Выделение эфиров стеринов и свободных стеринов путем твердофазной экстракции на силикагеле проводят в 2 этапа. На первом через твердый экстрагент пропускают нижнюю фазу, растворитель упаривают, пробу растворяют в гексане. На втором твердый экстрагент последовательно обрабатывают раствором гексана, 1%, 8% и 15%-ным раствором эфира в гексане. Изобретение позволяет одновременно в одной пробе определять 3 класса стероидов : экдистероиды, стерины и их сложные эфиры, одновременно обеспечивается не менее 80%-ное выделение стероидов. 2 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (g1)q А 01 К 67/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHAM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4469678/30-13 (22) 01.08.88 (46) 23,12.90.Бюл. ¹ 47 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологических методов защиты растений (72) Л.С.Кейсер и B.Н.Ретунский (53) 632.937.32(088.8) (56) Thompson N.J. et а1. Techniques

for the isolation and identification

of зйегох1з in insects and Algae .

Lipids> 1980 vo15д9> pа719а (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДОВ В

НАСЕКОМЫХ (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к методам разработки питательных сред для массового разведения насекомых, используемых для биометода. Цель — повышение эффективности за счет ускорения процесса. Новый способ включает экстракцию пробы насекомого смесью растворителей: хлороформ - метанол или хлористый метилен — метанол (2:1), обработИзобретение относится к области сельского и лесного хозяйства, а именно к методам разработки питательных сред для массового разведения насекомых, используемых для биологической защиты сельскохозяйственных растений.

Целью изобретения является повышение эффективности за счет ускорения процесса.

Пример 1. 1 г яиц зерновой моли обрабатывают 15 мп смеси хлорис„„SU„„1614774

2 ку экстракта водой, а после расслоения фаз выделение целевых фракций методом твердофазной экстракции. Выделение экдистероидов из верхней фазы производят путем твердофазной экстракции на силикагеле с химически привитыми октадецилсилановыми группами последовательной обработкой экстрагента водой, 25-и 50%-ным раствором метанола в воде. Выделение эфиров стеринов и свободных стеринов путем твердофазной экстракции на силикагеле проводят в 2 этапа. На первом через твердый экстрагент пропускают нижнюю фазу, растворитель упаривают, пробу растворяют в гексане. На втором твердый экстрагент последовательно обрабатывают раствором гексана, I-8-и 15%-ным раствором эфира в гексане. Изобретение позволяет одновременно в одной пробе определять 3 класса стероидов: экдистероиды, стерины и их сложные эфиры, одновременно обеспечивается не менее 80%-ное выделение стероидов, 2 табл. тый метилен — метанол (2: 1), измельчают с помощью ручного стеклянного гомогенизатора, и экстракцию проводят в течение суток при комнатной температуре. Экстракт фильтруют через бу-мажный (или стеклянный) фильтр в делительную воронку и добавляют 4 мл

Н О. После встряхивания смеси происходит расслоение смеси на верхнюю и нижнюю фазы. Нижнюю фазу отделяют.

Верхнюю фазу 2 раза обрабатывают хлористым метиленом (по 5 мл), кото1614774

pI>lA затем добавляют к нижней фазе.

После этого нижнюю фазу 2 раза обрабатывают водой (пс 4 кл), присоединяя водный раствор к верхней фазе, После второй обработки водой нижнюн> фазу фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом, натрия„

Из верхней фазы, содержащей экдис ероиды, упаривают метанол на ротор- !0. нГ>м испарителе при 40-45 С, из води >го остатка производят выделение стероидов путем твердофазной экстракцйи. Для этого водный раствор пропускают через 0,5 г силикагеля с хими- 15 чески привитыми октядециГГсилановыми группами, затем твердый экстраге I= обрабатывя>от водой (5 мл) 25 в и

5(1.-ными растворами метанола в воде (1по 5 мл), собирая последнюю фракцию 20 дпя аналитических определений.

Из нижней фазы производят выделение стеринов и их эфиров путем твер— дрфазной экстракции на силикагепе.

Д!пя этого на первом этапе нижнюю фазу 5 п >опускают через твердый экстр агент (О, 5 r ) при э том lla нем остаются полярные липиды. Полученный раствор нейтральных пипидов упаривают Hà рО торном испарителе при 25" 28 С, оста-ток растворяют в 4-5 мл гексана и пропускают через новую порцию экстрагента (0,5 г). Далее поспедоватепь—

vo обрабатывают экстраге1-::.т 2 .кп гекcaHà, 5 мл 1> .-ного раствора эфира в

Г1е ксяне,фр акция эфиров с таримов ), !

lO мл 8/.-ного p acti>op a эфи>а в Гекс яa ) е (фракция триглн>:, ридов и свобод1- Гх кислот отбрасывается) 10 l,п ! 5%-ного раствора эфира в гексане !!фракция .свободных стеринов)= ВГ:>дев

11енн>ые фракции .-Использукп p>I:. ГГГ>оведения аналитических o ..:ред3»31ен:- и „

П вЂ” =I и е р 2. 2 г бабо-.ек зернс-ВОЙ моли Об1>яб ать:веют 20 кл смеси

Хлороформ -- метанол (2;1; H далее выполняют последователь"1-:ест:ь операций как в примере 1, Результаты опредепеГГ.= и по при> е-рам и 2 представпень1 в табл„1, Пример > (оценка правипьнос:H . 1>редлагаемсго способа) . )1тГя Оценки правильности способа подготовки пробы использу1:>т мод.льную смесь, в которую входят прецстявите55 пи классов экдистероидов, эфиpGB стеринов и cBI>áoäíûõ стеринов, а также мешающие определению вещества (углеводороды„ тригпи „ериды, свобОд}11>е ж>11>1>ые кис Io >4 у 31>осфолиГ1идь1)»

Сме<-.ь Hailnc>lz на субстрят из насекомых, из которых удалены пипиды, в том числе и cTepoиды (субстрат — яйца зерновой копи, обработанные избытком (дважды) смеси хлороформ-метанол) .

Ня 2 г субстрата наносят,мкг: xo-!

lee.терипбензоат (эфир стериня) !05, эргостерин (свооодный стерин) 180, экдистерон (экдистероид) 40, 8-додецен (углеводород) 2000, оливковое масло — 80Х триолеина (триглицериды) 28000, олеиновая кислота (жирная кислота) 28000, лецитин (фосфолипид ) в 2 мп хлористого метилена, 5000.

Через ч производят экстракцию и выделение:Ге11евых фракций „Конеч—

;ое определение стероидов производят спектрофотометрическим методом при указанных значениях длин волн на осноье построения калибровочного графика„ Максимум поглощения дпя холестерилбе>Гзоятя составляет 228 нм, эргостери:,а 282 нм, экдистероня 242нм.

Количество мешающих веществ более, чем в 150 раз превышает количество определяемых стероидов, причем мешающие вещества сами обладают значительным поглощением в указанных областях

УФ-спектра. Результ т 1,п одгOTOBKH проб и анализа представлены в табл.2

{число повторностей п=3)

Предлагаемый способ позволяет одновременно в одной пробе определять три класса стероидов: экдистероиды, стерины, я.;»:лож>.ые =фиры, при этом обеспечивая гся не менее, чем 80/-ное выделение стеpоидoг» о

Формул я и-.:.обретения

CпО::.об определения стероидов в насекомых, включающий экстракци>с стероидс в сМес:ю растворителей. послеПующ е выделение целевых фракций и . ..Jlel-: . иф .. К<1цию с «" ерОГГ7. GB с помощью IIeхтроф соме. ря, о т л и ч я ю щ и йс я тем,, что,. с цел. ю повь:шения эффективности зя счет ускорения процесса.„ экстракцию стероидов про.=.одят

«-ìeeью хлс>роформ - метанол «lail хлористый метипен — метанол IpH cooTHo

U. eHHH Ko!iIIoHeíт1>в 2;. выделение целевых фракций проводят после обработки экстракта водой и 1>ясслоения ф:1.3 методом твердофаз ной экстр акции, 1>ричем выделение экдистероидов из

B"I»I"eH фазы проводят путем твер4774 6 чем первоначально через твердый экстрагент пропускают нижнюю фазу, растворитель упаривают и остаток раст5 воряют в гексане а затем новую пор3 цию экстрагента последовательно обрабатывают гексановым экстрактом и смесью эфира с гексаном с увеличивающимся содержанием эфира от 1 до 157.

1р -в гек".ане.

Т а Ь л в ц а I

Пример

Нетод и результаты определения стероидов

Объект нсслецоЭхстрагент ванна азанндхостная хро- Спехтрофотбметрнческое матография определение

ФлуорнметоэффекВесовое распрелелекие эфиры стееинов — --" — — с2 свободные видк ахрамарнческое определекне

7 - 282 Р -242 с те рикы

Иле нтифици ров акы: в эфирах стер><нов: холестерин гитостерин

JP-холестерин свободные стеркныс холестерин эргостерин кампестернн ситостерик !!айлеко, 11/Сс холестерин 575 кампестернн 45 ситостернк 107

1 Яйца зерновой моли

Хлористый метилек " метанол (2:I) Общее содер- Общее содерканне g з 7 — канне экдистернков,2/г:стероидов эфиры сТЕ- 21 ° 9 )(/г ринов 56с6

1 34

А-2,50 свободные стернны

53,1

5,0 $/г

Эфиры стерн- 13 f/r нов 42,0 J /r

Иден тифасцнров аны в(-экдщзон н экднсте рон

Хлороформ — ме- 15 талал (2 с ) 2 ° 40

Идентифнцироваиыс в эфирах стеринов:

2 Бабочки зерновой моли

Свободные стернкы холестерин кампестерин стнгмастернн ситастерик в свободных сгсрннахс холестерин зргостернн стнгмастерик снтостермн

I BS t /r

Таблица 2

Эргостерин

Экстрагент

Халестерклбекзоат ад

CTCPOk ако> Выделено, Процент SR Задана Выделено ° мкг мхг выхода

-1-! с

Хлоркстый метилек - метанол

105 94 89,5 11,2 180 145 80,5 5,4 40 39 97,5 6,2 (2с !) Хлороформ - метанол (2:I) 105 92 87 Ь 10 7 180 147 81,6 11,2 40 38 98,0 6,4

П р к н е ч а к н е. Бх — относительное стандартиое отклонение, Составитель В. Горбатовский

Техред М.Дидык Корректор Л.Бескид

Редактор Н,Бобкова

Заказ 3941 Тираж 450 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул . Гагарина, 101 дофазной экстракд)(и ыа силикагеле с химически, привитыми октадецилсила— новыми группами последовательной про мывкой -7)ep/(oro экстрагента водой, 25- и 50%-ным раствором метанола в воде, а выделение сложных эфиров стеринов и свободных стеринов проводят путем последовательной твердофазной экстракдии на силикагеле, при—

Ппя зхди- Системс раст- стерона, ворктелейс им (ацетоинт"

Э «380 рнл - вода )I„&36 (411) н метаиалДлл 4(-зкдн- вода (42:58) зона нм сла390, Идентнфицнро- с)С ° 440 ваки g -экднОбщее со- зон к зкдистедервание, ров

20,! $ /r