Способ получения рекомбинантной плазмидной днк phtn 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека
Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидной ДНК PHT N 713, кодирующей фактор некроза опухоли. ДНК плазмиды конструируют в результате культивирования человеческих макрофагов с индуктором, отделения фракции, содержащей и-РНК человеческого ФНО, от индуцированных клеток, получения одн-ДНК из и-РНК с использованием обратной траскриптазы с последующим превращением в дн-ДНК, введения дн-ДНК PBR 322, трансформации рекомбинантным вектором организма-хозяина и получения клонов субклонирования к ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО или его главной части, из отобранных клонов выделяют рекомбинантную плазмидную РНК PHT N 713.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (19) (И) (51)5 С 12 N 15/28
К ПАТЕНТУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 3869300/30-1 (22) 05.03.85 (31) 43617/84 (32) 06.03.84 ..f33). JP, (46) 15.12.90. Бюл. Р 46 ..Ф . (71) Дайниппон Фармасьютикал Ко Лтд (1Р) (/2) Масааки Ямада, Ясуджи Фурутани, Мицие Нотаке и Инити Ямагиси (JP) (53) 575,224.2:577.2 (048) (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ))ЦЯ РЕКОМБИНАНТНОЯ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHTN 713, КОДИРУ10ЩЕЙ
ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидИзобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидной
ДНК, кодирующей фактор некроза опухоли человека.
Способ заключается в том, что конструируют ДНК плазмиды в результате культивирования человеческих макро.фагов с индуктором, отделения фракции, содержащей и-РНК человеческого ФНО, от индуцированных клеток, получения одн-ДНК из л-PHK с использованием обратной транскриптазыс последующим привращеж ем в дн-ДНК, введения дн-ДНК в вектор, трансформации рекомбинантным вектором организма хозяина и получения клонов, субклонирования к-ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО или его главную часть из отобранных кло2 ной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли. ДНК плаз миды конструируют в результате культивирования человеческих иакрофагов с индуктором, отделения фракции, содержащей и-PHK человеческого ФНО, от индуцнрованных клеток, получения одн-ДНК из,и-РНК с использ ованием обратной транскриптазы с последующим превращением в дн-ДНК, введения дн-ДНК рВК 322, трансформации рекомбинантным вектором организма-хозяина и получения клонов субклонирования к ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО или его глацной части, из отобранных клонов выделяют рекомбинантную плазмидную PHK pHTN 713.
10 табл, нов и выделяют рекомбинантную плазиидную ДНК, кодирующую челоьеческий
ФНО, Данные, иллюстрирующие предлагаемый способ, приведены в табл. 1-1, 1=2 2 1э 2 2 ° 3 10 °
Пример 1. Получают макрофаги
;человека. Полученные макрофаги высевают в чашку с плотностью клеток, равной приблизительно от 2 ° 10 ) до 1 10 клеток на 1 см и предварительно культивируют при 35»38ОС, предпочтительно при 37 (., в атмосфере 1007-ной.влажности, содержащей 5% двуокиси углеро- ( да, в течение приблизительно от 30 мин до 2 ч.
Затеи в качестве индуктора прибавляют эндотоксин, полученный из грамотрицательных бактерий, например ли1614 765 иополисахариц, полученный из Escheri—
chia coli; Pseudomonas aeruginosa или
Salmonella гуЬ1, а в качестве ингибитора синтеза белка прибавляют цикло5 гексимид. Культивирование продолжают еще в течение 3-8 ч для накопления и-PHK человеческого ФНО в макрофагах, Количество эндотоксина, как правило, равно около 1-100 мкг/мл. В качестве индуктора можно дополнительно прибавить форболовый сложный эфир, такой как форбол-12-миристат-13 — ацетат„ форбол-12, 13-дидеканоат или форбол-12,13-дибензоат в количестве прибли- 15 зительно 1-2000 нг/мл, Количество ингибитора синтеза белка варьируется в зависимости от его типа, Например,в случае циклогексимида оно равно
0,1-50 мкг/мл. В качестве культураль- 20 ной среды можно использовать различные культуральные среды, пригодные для культивирования клеток млекопитающих
;, (RPM1-1640, MEM — среду Eagle и модифи кацию Dulbecco MEM-среды). В предпоч- 25 тительном варианте в культуральную среду прибавляют сыворотку животных (такую как эмбриональная бычья сыво. ротка или сыворотка теленка) в количестве приблизительно 1-20_#_, 30
После культивирования экстрагируют общую РНК из клеток, а затем аффинной колоночной хроматографией на олиго(дТ)-целлюлозе или поли(У)-сафарозе-и отделяют фракцию, содержащую поли(А)
-и-РНК, Фракцию, обогащенную и-PHK человеческого ФНО, получают обработкой фракции поли(А)-и-РНК электрофорезом на кислотно-мочевинном агарозном геле или центрифугированием в гра- 0
40 диенте плотности са:.-арозы, Для подтверждения того, что получают фракцию и-РНК, кодирующую человеческий ФНО, и-РНК транслируют в белок и проверяют его биологическую активность. Вводят и-PHK в ооциты Xenopus
1aevis и анализируют цитотоксической активностью и ч Сго по отношению к мьппиным клеткам L транслированного белка.
Пример 2, Поли(Л1-и-РНК или обогащенную и-РНК Фракцию используют в качестве матрицы, а олиго(дТ) — в качестве затравки для синтеза одн-ДНК с использованием обратной транскрептазы
55 (например, полученной из вируса птичьего миелобластоза в присутствии дАТФ, дПТД, пГТп и дТТФ), Оид-ДНК используют в качестве матрицы и синтезир ззт дн-ДНК с использованием обратной транскрептазы или ДНК-полимеразы
Е.cali.
Результирующую дн-ДНК вводят в, плазмиду pBR 322, расщепленную Pst эндонуклеазой рестрикции. Результирующие рекомбинантные плазмиды вводят в клетку-хозяин, такую как Е,coli Х 1776у получают набор клонов к-ДНК путем отбора колоний, устойчивых к тетрациклину, Набор к-ДНК подвергают гибридизации с использованием Р-меченного фрагмента к-ДНК кроличьего ФНО, отбирают целевые клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, имеющие к-ДНКвставку, кодирующую полипептид человеческого ФНО, 92
P-Меченную к-ДНК синтезируют с использованием фракции поли(А)-и-РНК или фракции, обогащенной и-PHK человеческого ФНО, в качестве матрицы, Отдельно в качестве матрицы используют фракцию и-PHK полученную по аналогич ной методике, за исключением того, что в качестве сырья используют неиндуцированные макрофаги и синтезируют
9Z
P-меченную к-ДНК. В качестве индуцирующей отрицательной пробы используют P-меченную к-ДНК. Из указанного за выше набора к-ДНК отбирают клоны плазмид, сильно гибридиэующиеся с индукционной положительной пробой, но не гибридизующиеся с индукционной отрицательной пробой.
Описанную ниже операцию проводят для того, чтобы подтвердить то, что результирующие клоны содержат вставку к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО, Плазмидную ДНК выделяют из вьппеуказанных клонов, превращают в однонитевую ДНК нагреванием или щелочной обработкой и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Фракцию и-РНК, содержащую и-PHK человеческого ФНО, добавляют к фильтрам для гибридизации с помощью фиксированной
ДНК. Выделенную и-РНК вводят в ооциты
Xenopus laevis для определения того, кодирует ли выделенная и-РНК полипептид человеческого ФНО.
Вышеуказанными способами получают трансформированные cHcтемы, имеющие рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагмент ДНК, имеющий иос; едовательность оснований, комилем.итарную и-РНК человеческо> о ФНИ.
Наличие гомологичности последовательностей оснований и установленных аминокислотных последовательностей человеческого ФНО и кроличьего ФНО указывает на то, что они филогенетически происходят из одного и того же гена, и свидетельствуют о том, что значи" тельная часть обычных участков представляет собой последовательность, необходимую для экспрессии биологической активности. Однако, как показано ниже, полный полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересе5
161ч76
Если полученные клонированные ДНК ,не содержат цельного участка, кодирующего полипептид человеческого ФНО, то отбирают к-ДНК большего размера
5 отбором иэ набора к-ДНК с использо. ванием в качестве пробы клонированных ФНО-фрагментов к-ДНК из трансформированных систем.
Клонированную к-ДНК, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность полипептида человеческого ФНО, анализируют путем определения последовательностей оснований некоторых фрагментов клонированной к-ДНК, обнаруживают последовательность оснований, гомологическую последовательность оснований к-ДНК кроличьего ФНО и отбирают те к-ДНК, которые содержат последовательность оснований, 20 соответствующую цельному кодирующему участку для полипептида человеческого
ФНО, Гомологичность между последовательностью оснований, кодирующей кроличий 25
ФНО, и последовательностью оснований, кодирующей полипептид человеческого
ФНО, а также гомологичность между установленными аминокислотными последовательностями полипептида кроличьего 30
ФНО и полипептида человеческого ФНО представлена, соответственно, в табл. 5 и 6.
Из этой гомологичности и из установленных N-концевых и С-концевых
35 аминокислотных последовательностей кроличьего плазменного ФНО делают вывод о том, что к-ДНК человеческого
ФНО кодирует полипептид-предшественник ФНО, содержащий 233 аминокислотных остатка, а сам полипептид человеческого ФНО представляет собой полипептид, соответствующий 155 аминокисI нотным остаткам от карбокси-окончания предшественника. 45
5 6 кается с ФНО кроличьей плазмы, Это указывает на то, что полная аминокислотная последовательность полипептида человеческого ФНО не всегда необходима для экспрессии активности, частично модифициро1занный полипептид человеческогп ФНО также обладает активностью, поскольку он содержит активный центр полного полипептида ФНО, Пример 3. Модификацию ДНК проводят расщеплением ДНК подходящей эндонуклеазной рестрикции и отщеплением одного или больше кодона подходящими экэонуклеазами и/или эндонуклеазами, взятыми индивидуально или в сочетании, с последующим замещением на дегенеративные или другие кодоны, например на кодоны, синтезированные химически по фосфотриэфирному способу или отщеплением кодонов, Пример 4, Получение полипептида человеческого ФНО.
Плазмиду, кодирующую полипептид человеческого ФНО, получают введением клонированной к-ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО, в подходящий вектор. Можно испольэовать все векторы, пролиферирующие в трансформируемых микроорганизмах.
Плазмиду для получения неслитого полипептида конструируют связыванием фрагмента ДНК, содержащего последовательность оснований, кодирующую полипептид человеческого ФНО, где иницииI рующий кодон АТС прибавлен к 5 -окончанию и стоп-кодон (ТАА TAG или
1
TGA) имеется в 3 -конце, с фрагментом ДНК, кодирующим промотор и последовательность Shine-Dalgarno. Плазмиду конструируют в результате введения фрагмента к-ДНК, имеющего последовательность оснований, кодирующую полипептид человеческого ФНО, где в
3 -конец добавлен обрывающий кодон, в вектор, в результате чего трансляционная считывающая структура соответствует структуре в структурном гене, Способ получения полипептида человеческого ФНО в форме слитого полипептида имеет преимущество, выражающееся в сведении к минимуму разложения продукта в трансФормированных клеткаххозяевах, Полный полипептид человеческого ФНО, соответствующий аминокислотной последовательности от серина в
82 положении до лейцина в 236 положении в верхних строчках табл, 6, не со7 1614765 8 держит метионина, Следовательно плазмида, сконструированная введением фрагмента к-ДНК человеческого ФНО, / связанного с 3 -окончанием последова5 тельности оснований структурного сливаемого гена через метиониновый кодаи (ATC), позволяет получить человеческий ФНО в виде слитого продукта способом расщепления метиониновой пептидной связи, например обработкой бромцианом..
Трансформированные организмы получают введением экспрессивного вектора В организм-хозяин,.такой KBK NHKpо . организм, например Е.coli. После это го культивированием трансформированных организмов получают полипептид человеческого ФНО или полипептид, содержащий метионин з N-окончании, Про20 дукт может накапливаться как в цитоплазме, так и в периплазме клеток-хозяев в зависимости от способа конструирования экспрессивного вектора, Дпя того, чтобы вызвать выделение полипеп-25 тида в периплазме, конструируют плазмиду с использованием гена, кодирующего секреторный белок, такой как ген щелочной Аосфатазы (phoA) или ген бел- . ка, связывающего фосфат (рпоБ), в ре- 30 зультате связывания ДНК, кодирующей полигептид человеческого ФНО,в правильной трансляционной считывающей структуре с указанным выше геном в подходящем месте после участка ДНК, 35 кодируошего сигнальный пептид.
Результирующие трансформированные организмы культивируют в подходящих условиях до полной выработки целевого полнпептида. После этого полипептид экстрагируют из культуры. После накопления выработавшегося полипептида г. ц . топлазме клетки-хозяева подвергают разрушению обработкой лизоцимом, замораживанием и размораживанием или 45 ультразвуковым диспергированием, либо с использованием пресса Френча, после чего центрифугируют или фильтруют и собирают экстракт, Полученный таким образом полипептид очищают обычными с.пособами очистки белков, например сочетанием высали.— вания, ультрафильтрации, диализа, ионнообменной хроматографии, гель-фильтрации, электрофореэа, аффинной хроматографии и т,д, I
Описанным выше способом получают полипептид человеческого ФНО по изобретению и/или полипептид с метионином на N-конце полипептида.
11 р и м е р 5. Под модифицированными полипептидами человеческого ФНО подразумевают полипептиды, полученные из аллельных мутантов ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО (аллельный мутантный полипептид), их получают в результате присоединения аминокислоты или пептида (состоящего иэ двух или более аминокислот) к Ы-окончанию или С-окончанию полипептида человеческого ФНО или аллельного мутантного полипептида, или в результате удаления одной или больше аминокислоты из голипептида чсловеческого ФНО, или аллельного мутантного полипептида (например, удаления 4 аминокислот из
N-окончания полипептида человеческого
ФНО), а также прои..водные, такие как сложные эфиры, ацильные производные или амиды кислот, образованные с использованием функциональной группы в молекуле, остатка амина в N-конце и.-..-; .карбоксильного остатка в С-конце, и их соли, образованные аминоостатками или карбоксильными остатками, например с гидроокисью натрия,гидроокисью калия, аргинином, кофеином, ппокаином, хлористоводородной кислотой, глюконо-.вой кислотой и т.п.
Модификацию полипептида человеческого ФНО или .его аллельного мутанfHQ
ro полипептида проводят по известным методикам,.
Химические и физико-химические ! свойства полипептида.
Молекулярный вес.
Молекулярный вес рЧ-ФНО измеряют
I гель-фильтрационным анализом на колон ке с TSK-гелем C 3000 SW в соответствии с жидкостной хроматографией высокого давления, используя 0,2 M фосфатный (рН 7) буфер с или без 8 М моченины и 0,57. 2-меркаптоэтанола в качестве растворителя. В качестве белков-маркеров молекулярного веса используют бычий сывороточный альбумин (ГИ 66000), кроличью триозефосфотизомеразу (MW 53000), яичный альбумин (MW 45000), свиной пепсин (MW 32700), соевый; чгибитор трипсина (МИ 20500), лошадиный миоглобин (MW 17800) и лошадиный цитохром-С (MW 12400).
В результате устанавливают, что рЧ-ФНО имеет мблекулярный вес 45000<
*5000 и 18000+3000 дальтон соответст1614765
10 венно в отсутствии и присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола, к-ДНК, введенная в экспрессивную плазмиду pHTR 91, кодирует 155 аминокислотных остатков (за исключением метионина, происходящего из инициирующего кодона АТС), Из установленной аминокислотной последовательности рассчитывают молекулярный вес рЧ-ФНО (17097 дальтон), Рассчитанный молекулярный вес согласуется со значением, определенным в присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола.
Этот факт указывает на то, что рЧ-ФНО присутствует в виде мономера (субъединицы) в присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола, но существует в виде агрегата, например в форме тримера, при отсутствии денатурирующих агентов.
Иэоэлектрическая точка, Изоэлектрическую точку определяют гель-электрофорезом с изоэлектрофокусированием при 3 Вт в течение 3 ч с 25 использованием пластинки 5 -ного полиакриламидного геля.и градиента рН от 4,0 до 6 5.
Белок окрашивают Кумасси бриллиантовым голубым. Отдельно гель нарезают 30 полосками 3 мм шириной и вымачивают ,в 20 мМ трис-HCl (рН 7,8) буфере для элюирования белка, Цитотоксическую активность четко наблюдают в элюате . из геля, вырезанного из места, соот35 ветствующего положению белка, определенному прокрашиванием.
Как было установлено, изоэлектрическая точка рЧ-ФНО равна 5,9+0,3, Аминокислотный состав., 40
Аминокислотый состав рЧ-ФНО определяют с помощью аминокислотного микроанализатора флуорометрическим способом с использованием ортофталевого альдегида после гидролиза образца хло45 ристоводородной кислотой.
50 мкг рЧ-ФНО гидролизуют в бн.НС1 при 110 С. Аминокислотный состав рассчитывают с корректированием на основе .значений, определенных в хая дом об- 0 раэце, гидролизованном 24,48 и 72 ч.
Цистин и цистеин определяют в виде цистеиновой кислоты, превращенной с помощью окисления пероксимуравьиной кислотой. Триптофан определяют по флуорометрическому способу, Результаты сведены в табл, 7, Аминокислотный состав хорошо согласуется с составом, рассчитанным из последовательности оснований, кодиру.— ющих полипептид человеческого ФНО.
Определение N-концевой аминокислотной последовательности.
N-Концевую аминокислотную последовательность рЧ-ФНО определяют по методике разложения Эдмана.
Фенилтиогидчнтоинаминокислоту, получающуюся иэ N-концевой аминокислоты в способе разложения по Эдману, идентифицируют с помощью жидкостной хроматографии .высокого давления с использованием колонки (4,6x250 мм) с TSKгелем ODS 120А. Эти операции многократно воспроизводят для определения новых последовательно образующихся
N-концевых аминокислот.
Обнаруживают последовательно, что
N-концевая аминокислотная последовательность рЧ-ФНО является следующей:
NH -Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Ргой
-Ser-Asp
Некоторые полипептиды, получаемые в микроорганизмах при применении технологии рекомбинантной ДНК, имеют в своих N-концах остаток метионина, получающийся из инициирукнцего кодона (АТС) .
Определение С-концевой аминокислотной последовательности.
С-Концевую аминокислотную последовательность рЧ-ФНО определяют ферментативным способом с использованием карбоксипептидаз. рЧ-ФНО расщепляют карбоксипептидаЗой-А и карбоксипептидазой 7 при молярных соотношениях Фермента ксубстра-. ту равных соответственно 1 : 25 и
1 : 1000. Свободные аминокислоты, выделившиеся из С-окончания рЧ-ФНО в результате двойного отщепления, идентифицируют на аминокислотном микроанализаторе через соответствующие интервалы времени от 2 до 180 мин после расщепления.
Устанавливают, что С-концевая аминокислотная .последовательность рЧ-ФНО является следующей: — - - Tyr-Phe-Gly-Пе-Ile-Ala-Ieu«.
-СООН.
Разложение рЧ-ФНО трипсином.
500 мкг рЧ-ФНО разлагают с помощью
20 мкг ТРСК-обработанного трипс прикомнатной температуре в течение 5 ч.
1614765
Разложенный продукт подвергают препаративному изоэлектрофокусирующему гель-электрофорезу. Белки окрашивают
Кумасси бриллиантовым голубым. В отдельном опыте гель нарезают полосками шириной 3 мм и нарезанный гель вы-* мачивают в 20 мМ трис-НС1 (pH 7,8) буфере для элюирования белка.
В результате устанавливают, что продукт разложения элюируемый из вырезанного геля, соответствующего зоне рН приблизительно на 0,3 более низко-го, чем изоэлектрическая точка рЧ-ФНО, обладает цитотоксической активностью.
В результате устанавливают, что частичная аминокислотная Iroследовательность продукта разложения является следующей;
N-концевая:-11Н -Thr-I ro-Бег Азр
С-концевая: - — Ile-Ala-Leu-COOkI.
Как показывает аминокислотная последовательность, продукт разложения представляет собой полипептид, получившийся в результате. отщепления четы-25
pez N-концевых аминокислот (Ser-Ser-Ser-Arg) от рЧ-ФНО, и обладает указаннсй выше цитотоксической активностью. Это означает, что по крайней мере четыре N-концевые аминокислоты в 30 э -!-ФНО не играют существенной роли в его биологической активности, Биологическая активность.
Цитотоксическая активность по отношению к мышиной клетке L-M.
Образец (О, 1 мл) серийно разводят указанной ниже средой и по 0,1 мл суспензии мышиных клеток 1.-II (100000 клеток на 1 мл) добавляют в кажцую лунку многолуночной пластинки.
Используют минимальную питательную среду Easelâ, содержащую 1% эмбриональной бычьей сыворотки,, Пластинку инкубируют при 37 С в течение 48 ч в поло, алостью влажной атмосфере, содержащей 45
5 углекислого газа. Ilocne инкубирования прибавляют 20 мкл 25 -ного глутаральдегида для фиксирования жизнеспособных клеток. После фиксирования пластинку промывают и сушат, После этого для окрашивания фиксирован- ных клеток прибавляют О, 1 мл 0,05 ного раствора метиленового голубого.
Избыток метиленового голубого отмывают и пластинки сушат. Метиленовый голу5» бой, связавшийся с фиксированными клетками, элюируют 200 мкл О, 36 н, НС1 н измеряют его поглощение при
665 нм. Поглощение пропорционально числу жизнеспособных клеток. Концентрацию биологической активности, требующуюся для умерщвления 50% клеток
T.-M, определяют как 1 ед./мл. Цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-If, определенную в указанных выше условиях, выражают как единицы (LM) для того, чтобы отличать от цитотоксической активности по отношению к мышиным клеткам L-929 как клеткам-мишеням.
Определяют содержание белка.
В результ; те устав-вливают, что рЧ-ФНО имеет удель ную активность
Ф равную 2 10 единиц (И1) и более на
1 мг белка.
Противоопухолевос действие на саркому Meth А, трансплантированную мышам.
Противоопухолевое действие на мышей с саркомой Meth А оценивают следующим образом.
Marrrax BALB/G MaccoH около 23 r внутрикожно трансплантируют 200000 клеток саркомы Meth А в кожу брюшины и через 7 дней отбирают мышей, у которых опухоль имела 6"7 мм в диаметре. На седьмой день после трансплантации опухоли рЧ-ФНО вводят в массу опухоли или внутривенно.. Содержание эндотоксина в рецептуре рЧ-ФНО меньше
У чем 0,01 нг на 1-10 единиц (LM) цитотоксической актив ности.
Устанавливают, что при введении в массу опухоли некроз опухолевого трансплантата наблюдается у всех мышей, которым ввели рЧ-ФНО в дозах 1 ° 10
3 ° 10э и1 ° 10+: единиц (LM) на мышь в течение 24 ч после инъекции, и опухоль полностью регрессирует в размере 3/5, 5/5 и 5/5 соответственно при каждой указанной выше дозе. При внутривенном введении некроз наблюдают у всех мышей, получивших инъекцию рЧ-ФНО в дозе 3 10 и 1 ° 10 единиц (LM) на мышь, и доля полной регрессии составляет соответственно 3/5 и 4/5, Ингибирующее действие рЧ-ФНО а рост клеток опухоли человека in vitro.
Ингибирующее действие рЧ-ФНО на рост клеток опухоли человека и нормальных клеток оценивают in vitro в следующих условиях. Клетки опухоли человека или нормальные клетки высеивают в количестве 10000 клеток на лунку в 1 мл минимальной питательной среды Еад1е, содержащей 101 эмбриональной бычьей сыворотки, с использо13
1614765
Таблица Х-I (5!)-ТСА ССТ ТСТ ССС ССС СТС ЛОТ САС ЛАС
ССТ CTA GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA
GAG
CGT ССС AAC GCC CTG CTG GCC AAC GGC ATG
AAG СТС ACG GAC AAC CAG CTG GTG GTG CCG
GCC GAC GGG CTG TAC СТС ATC TAC TCC CAG
GTT CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC
TAC GTG CTC CTC ACT CAC ACT GTC hGC CGC
TTC GCC GTC ТСС TAC CCG AAC AAG GTC AAC
СТС CTC TCT GCC ATC AAG AGC ССС TGC CAC
CGG GAG ACC ССС GAG GAG GCT GAG ССС ATG
GCC TGG TAC GAG ССС ATC TAC CTG GGC ССС
GTC TTC САС TTG GAG AAG GGT GAC CGG СТС
AGC ACC GAG GTC AAC CAG CCT СЛ6 TAC CTG
GAC СТТ GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC ТТТ
GGG ATC ATT GCC CTG-(Э 1.)
Таблица Х-2
Arg Ala Leu Ser Asp Lys
Чаl Чаl А1а Asn Pro Gln
Ser Ala Ser
Pro
Lqu Ala His
Glu Gly Gln
Ala Asn Ala
Уаl
Leu Gln Trp Leu Ser Gln Arg
Leu Leu Ala Asn Gly Met Lys
Asn Gln Leu Ча1 Val Pro Ala
Leu Thr Asp
Asp Gly Leu
Туг-Ьеи Ile Tyr Ser Gln Val ванием пластинки с 24 лунками, Добавляют рЧ-ФНО в результирующей концентрации 100 единиц (T.M)/мл и затем культивируют при 37ОС в течение 4 дней в полностью влажной атмосфере, содержащей 5Х двуокиси углерода, За 4 дня до окончания культивирования в каждую лунку прибавляют 1 мкл Н-тимидина.
После культивирования клетки промыва- 10 ют фосфатным солевым буфером и лизируют с помощью О 5Х-ного додецилсуль3 фата натрия, Количество Н-тимидина, введенное в клетки, определяют, измеряя радиоактивность лизата. 15
Ингибирующее действие в виде доли ингибирования роста, рассчитываемой по следующему уравнению:
Доля ингибирования роста (Х) (а — Ь)(а ° 100), где а и Ь представ 0 ляют собой радиоактивность, введен-. ную в клетки соответственно при отсутствии рЧ-ФНО и в присутствии рЧ-ФНО, I
Результаты, сведенные в табл. 8, показывают, что рЧ-ФНО существенно ингибирует рост клеток опухоли человека, но не влияет на нормальные клетки, Это наблюдение показывает, что рЧ-ФНО селективно атакует опухолевые клетки.
Иммунологические свойства, Раствор рЧ-ФНО (100 единиц (LM)/мп) смешивают с равным объемом разбавленного в 100 раз очищенного антитела против кроличьего ФНО. После инкубирования при 37 С в течение 2 ч измеряют цитотоксическую активность реакционной смеси.
Продолжение таблицы 1-2
Gln
His
Gly
Thr
Phe
Ser
Leu
Gly Cys Arg
Thr Val Ser
Tyr
Ser
Phe
Ala
Asn Lys Val
Ser Pro Cys
Ala Glv Pro
Val
Tyr
Ile
Glu
Ser
Ala
Pro
Pro
Lys
Glu
Аяп
Ьеи
Ser
His
Arg
Gl u
Thr
Al a
Met
Glu
Val
Pro
ТГД
Phe
Tyr
Gln
Glu
Asn
Ser
Ьеи чу
Lys
Gln
The Glu
Asp
С3,, Gly
phe
Glu Ser
А2а .Leu
Leu
Х1е
Il e
Таблица 2-Х (5 )-AGC ACT GAG AGT ЬТС ATC CGG GAC GTC
GAG СТС GCG GAG GGG CCG СТС ССС AAG AAG
GCA GgG GGG ССС CAG GGC ТСС AAG CGC TGC
СТС ТОС СТС ЛСС СТС ТТС ТСТ ТТС СТО СТС
GTG GCT GGA .ССС ACC ACG Стс ТТС TGC CTG
TTC
GTG ATC GGC ССТ CAG
AGG
GAG
CCA ААС AAC CTC CAT
CAG ТСС
GAG
CTA
GCC CAG ATG GTC ACC
GTC
CCT
GTG
СТС
TCT CGG ССС CTG AGT GAC AAG
GCC
CAC
GTA GTA GCA AAC CCG
CCT CTA
СТС CAG TGG CTG AGC CAG
GGC
CAG
AAC
ССС CTG CTG GCC AAC GGC ATG
GCG
GAC
AAC CAG CTG GTG GTG
CCG
ACG
CTC
CAG
TAC CTC ATC TAC TCC
GCC GAC
CTG
TCC
АСС GGT CAA GGC TGC CGC
ТТС
CTC
CGC
CTC ACT CAC ACT GTC AGC
ТАС GTG
СТС
TAC CCG AAC AAG GTC
GCC
TTC
ATC AAG AGC ССС TGC
CAC
TCT
CTC
ACC ССС GAG GAG GCT GAG CCC
TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC
CAG ТТС GAG AAG GGT GAC CGG
GAG GTC AAC CAG ССТ GAG TAC
GCC GAG TCC GGG CAU GTC TAC
ATT GCC CTG-(3 ) GCC
TGG
GTC
TTC
AGC
GAC
АСС
CTT
ATC
GGG
Tyr Бeu Gly
G2y Asp Arg
Pro Glu Tyr
Gln Val Туг
ATG
GGC
СТС
CTG
TTT!
Таблица 2-2
Ile Arg Asp Val Glu
Leu Pro Lys Lys Л1а
$ег Lys Arg Cys Ьеа
Ser Phe Leu Leu Val
1(:1а 763
$er Thr Glu Зег Net
Leu Ala
Leu
Ala Thr Thr Leu Phe
Cys Leu
Gln Glu
Arg Чаl Пе Gly Pro
$er Pro Asn Asn Leu
Glu
Glu Gln
His Leu Чаl
Asn Pio Чаl Ala Gln Net Чаl Thr Leu
Arg
Pro
Lel3 Яег
Ala Asn
Ser Ala
Leu Ala
Ser Arg Ala
His Val Val
Asp E ys
Pro G1n
Val
Яег Gln
Glu Gly
А1а Asn
G3n Leu Gln
Ala Leu Leu
Trp Leu
Ala Asn
Сlу Het
Val Pro
Leu Val
Leu Thr
Asp Gly
Leu Phe
Ser Gln Чаl
Туг
Phe
Val Leu
Ala Val
Asn Lys
Ser Pro
Leu
Cys His
Leu Ser
СХи Thr
Arg
Ala
Ala Glu Pro Het
Trp туг
Phe.Gln
Gly Gly Ual
Arg Leu Ser
Tyr Leu Asp
Glu Ser Gly
Ala Leu
Gln Val Tyr Phe Gly
° а ° o s
Табдщр 3
aeII 40 50 60
1 1 l
ATGAGCACTGAQAGTATGATCCGGGAC
TACTCG ZGACTCTCATACTAGGCCCTG
10 20! 1
GQGGGGGGGGGGGGGCCCTCTGGAQAGA
CCCCCCCCCCCCCCCGGGAGACCTCTCT
70 80 90 100 110 120
1 В 1 t I 1
GTCG AGCTGGCGGAGGGGCCGCTCCCCAAGAAGGCAGGGGGGCCCCA GGCTCCA
CAGCTCGACCGCCTCCCCGGCGAGGGGTTCTTCCGTCCCCCGGGGGTCÑCGÀGGT
НаеХ
130 140 150 160 170 180
1 1 t Ф t I
TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTGCTCGTGGCTGGAGCCACCАСССТСТТСТСС
АСССАСЛСССЛСТСССЛСЛАСАСАААССЛССЛССАСССЛССТСССТССТСССАСААСАСЯ
G1y Gly
Cys Leu
Иа Gly
His Phe
Thr Glu
Leu Ala
Xle Ile
Glu Gly Pro
Pro Gln Gly
$ег Leu Phe
Asp Asn Gln
Leu Tyr Leu
Ser Gly Gln
Leu Thr His
Ser Tyr Pro
Ala Ile Lys
Pro Glu Glu
Glu Pro Ile
Ьео Glu Lys
Ual Asn Gln
I1e Туг
Gly Cys
Thr Val
Тук Leu
Gly Asp
Pro Glu
Arg Ser
Ser Arg
Val Asn
Arg
Ьуа
Ala
1б14765 20
ПРололжение табл.3
190 200 210 220 230 240
t ! !
CTGCTQCACTTCAQGGTGATCGGCCCTCAGGAGGAAGAGCAGTCCCCАААСААССТССАТ
QACGACGTGAAGTCCCACTAGCCGGGAGTCCTCCTTCTCGTCAGGGGÒÒÒGÒÒGQÀGGÒÀ
250 260 270 280 90 300 ! ! !
CTAQTCAACCCTGTGGCCCAGATGGTCACCCTCAGATCAGCTT CCCTGAGTGAC, GATCAGTTGGGACACCGGGTCTACCAGTGGGAGTCTAGTCGAA GGGACTCACT4
310 320 330 340 350 360
t ! !
AAGCCTCTAGCCCACGTAGTAGCAAACCCGCAAGTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTQAGC
TTCGGAGATCGGGTGCATCATCGTTTGGGCGTTCACCTCCCGGTCGЛООТСАССОАСТСО
370 .380 390 400 410 420 ! t ! ° )
CAGCGTGCGAACG CCCTGCTGGCCAACGGCATGAAGCTCACGGACAACCAGCTGGTGGTG
QTCG CACQCTTGCGGGACGACCQGTTGCCGTACTTCGAGTGCCTGTTGGTCGACCACCAC
430 440 450 460 470 . 480
t Р t
CCQQCCQACGGQCTQTACCTCATCTACTCCCAGGTTCTCTTCAQCGGТСААООСТОССОС
QGCCQQCTQCCCQACATGQAGTAQATGAGGGTCCAAGAGAAGTCGCCAGÒÒÑÑGAÑGGÑG
490 500 510 520 530 540 ! t t t
TCCTACQTGCTCCTCACTCACACTGTCAGCCGCTTCQCCGTCTCCTAСССОАЛСААООТС
AQGATQCACQAQGAGTGAGTGTGACAGTCGGCGAAGCQQCAGAGGATОООСТТОТТССАО
550 560 570 580 ! t t
AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCACCGGGAGACC
ТТООАООАОАОАСООТАОТТСТСООООАСООТООСССТСТОО
590 600
t !
GAGGCTGAGCCC
CTCCGACTCGGQ
610 620 630 640 650 660 ! ! !
ATGGCCTQGTACGAGCCCATCTACCTGGGCGGCGTCTTCCAGTTGGAОAAGGGTGACCGG
TACCGGACCATGCTCGGGTAGATGGACCCGCCGCAGAAGGTCAACCTÑÒTÑÑÑÀÑÒGGCÑ
670 680 690 700 710 720 ! t ° ., t t
CTCAGCACCG AGGTCAACCAGCCTGAGTACCTGQACCTTGCCQAQTCCGGGCAGGTCTAC
GAQTCGTGQCTCCAGTTGGTCGGACYCATGGACCTGGAACGGCTQAGОCCCGTCCAGATG
730 . 740 750 760 770 780 !
t ! !
TTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGGGACTGACCACCACTCCTCCCCCTСТСССЛССССАОС
AAACCCTAGTAACQGGACACTCCCCTGACTGQTGGTQAGGAQGGGGAGÀGGGÒQGGGÒCG
790 800
t t
CCCCTCACTCTGQQCG CC! TCAG
QQQGAGTGAQACCCGCGGGAQTC
21
22
Таблица 4
GACCCACGG
-30 -20 -10 -1! I I 1
CTCCACCCTCTCTCCCCTGGAAAGGACACC
1 10 20 . 30
1 I 1
ATG AGCACTGAAAG CATG ATCCG G GACG TG
HetSerThrGluSerHetIleArgAspVal
40 50 60
t I
GAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAG
- 6luLeuAlaG1uGluAlaLeuProLysLys
70 . 80 90
1 1
ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGC6GTGC
ThгС1уС1уProGlïG1óSåгЛг1ЗArgCys
100 110 120
Ф 1 I
TTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC
LeuPheLeuSerLeuPheSerPheLeuIle
130 140 150
1 1 t
СТСССЛССССССЛССАСС СТСТТСТСССТС
ValAlaGlyAlaThiThrLeuPheCysLeu
160 170 180
I 1 1
CTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGG
LeuHisPheGlyValIle6lyPro6lnArg
190 200 210
1 1 1
GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC
GluGluPheProArgAspLeuSerLeulle
220 230 240
1 1 1
AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGA CATCT
SerProLeuAlaGGlnA1aVa1Arg еrSeг
250 260 270
1 1 1
TCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC
SerArgThrProSerAspLysProVa1Ala
280 290 300
1 1 I
CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAG6GG, HisValValAlaAsnProGlnA1a6luQly
310 320 330
1 I
CAGCTCCAGT6GCTGAACCG CCGG6CCÀAÒ
GlnLeuGlnÒr pLeuAsnAгgЛгдА1аAsn
340 350 360
I 1 I
GCCCTCCTGGCCAATG6CGTG6AGCT6AGA
А1 аЬеоЬеиЛ1аЛап61уЧа LGluLeuArg
24
Продолжение табл.4
370 300 390
1 I 1
QATAACGAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGC
AspAsnGl nLeuValVa1Pr oSe r Gl uGly 400 410 420
1 1 I
CTQTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC
LeQTryЬецI1eТуrSeгСlnValLeuPhe
430 440 450
I 1 I
AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG
ЬувС1уС1nGlyCysProSerThrHisVal
460 470 480
1 1 1
CTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC
LeuLeuTbrHisThrIleSerArgI1eAla
490 500 510
1 1 I
СТСТССТАССАСАССААССТСААССТССТС
ValSeгТугС1пТпrLysValAsnLeuLeu
520 530 540
1 I 1
TCTGCCATCAAGAGCCCCrGCCAGAGGGAG
SerAlaI1eLysSerProCysGlnArgGlu
550 560 570
1 1 1
ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGG
ThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrp
580 590 600
I 1 1.
TATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC
ТугС1оРгоХ1еТугЬeuGlyGlyValPhe
610 620 . 630
1 1 I
CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT
GlnLeuG1uLysGlyAspArgLeuSerAla
640 650 660
t 1 1
GAGATCAATCGGCCCG ACTATCTCGACTTT
С1и 11еАБпАгуРгоЛярТугЬeu As pPhe.
670 680 690
1 r 1
GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATC
A1aGluSerGlyG1nValTyrPheGlyIle
00 710 720
t 1 1
ATTGCCCTGrGAGGAGGACGAACATCCAAC
11еА1а):
730 740
1 1
СТТССС АААССССТССССТСС
26
1614765
Таблица 5 бО сслс
GGAG
120 тест с
150
180
CgGCACTI TGATCGGCC A Gg
CTGCACT TGATCGGCC "Л
-GAAGA — СС GG:iCÑÒ CT ! 240
С СС GGCCCA — — — С
С С CCC GGCCCA KTGGTC С
270 и — с—
ЯОС С фА6ТОАСААО
300
330 с лссц gC
ЗбО
ЗС -,CCC
G 1
390 лссх с! 614765
Проползание табл.5
TGTACCTCATCTACTCCCAG
TGTACCTCATCTACTCCCAG
450.
Ятс ) accg
QTCAGC отслас
510
CG CGCCGTCTCCTACC CgEC AAGGTC
CG CGCCGTCTCCTAC E) AAGGTC
540
KACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC
AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC
570
gcc
APAGGGGGCT(AG3PC
CPAGGAGGCTGAG C
600
TGG С
Г - Стаат „.А
630
GGAGAAGGGTGACCGA
GGAGAAGGGTGACCGG
TCAG А ГС (3QGC GE TP C
660
690
А Т ГТассалатаМСССАьСТСТАС й(С ГТСССОА07 фСССАЖТСТлС
TTTGGGATCATTGСССТСТС
TTTGGGATCATTGCCCTGTG
П р и м е ч а н и е, Верхние строчки: последовательность оснований, кодирующая человеческий ФНОпредшественник, Нижние строчки: последовательность оснований, кодирующая кроличий ФНО-предшестве .ник, Области, заключенные в прямоугольник, являются гомологичным участком.
Обозначение "- †" показывает удаление кодона, Обозначение "хкк" показывает обрывающий кодон.
29 зо
Таблица 6
161ч765
Ile Arg Asp Val
1 мя и 1
Glu А1а
Gly Pro
Glu Ье
С1и Ье
Se Arg rg Cys
Se Lys ги Сув
Thr
Ala
Le Phe
Ье Cys
Ile
Ееи
60
Gly
Arg
Arg
Glu
lu Gl. --- Phe r Arg Asp eg Ser eu
1и С1г Gln See ed, Asn Лвп Led His .еи
Е1е Ser (Ргс Leu la Gl --- --- Ala Val
Val Asn Pr Val la Gl Met Val Thr Leu
rg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys г вег Ala Яег Лг I Ala Ьеи (Бег Лвр Ьув
100
Pro Ча1
Pro Leu
110
Asn Arg
Ser Gln
Ala
Val
120
Val
Met
130
Glu eu Arg
Lys eu Thr
eu Va
eu Val Val Pro
16! 4765 32
Процоп,кение табл.6
x Leu !Хе Туг Бег Gln r Leu Ile Т г Ser Gln
Ser Glu
А1а Asp
?.уз РТу Gln Gly Cys Pro (Бег)
Бег 1у Gln Бу СУs Arg (Вес)
Xle Гег
Val Ser
170 ту7 Gln Thr,ys Va тД Pro Asn а Val
180
Thr His м ягойr
Arg !le
Аг Phe
Asn Keu I eu Зег Ala
Asn Eeu Leu Ser Ala
Glul Gly lа Glu Ala
G lu Glu la Gl Pro
200
Gln
His
Lys Pro
Met Ala
:Pro Ile Tyr Leu Gly
Pro Х1е Т г Leu Gl
210
Gly Ча Phe Gln Leu 61и Lys Gly Asp Arg ll Р у Я1
220 . Leu Ser Ala flu Пе Бп1 Arg (Рго Asp Tyr
Leu Бег Thr lu Val psn Gln Щ Glu T r !
Г ° 230
ГейЛяЯ Phe Ala Glu Бег Gly Gln Val Туг
Ьеи As Ьеи Ala Glu Бег Gl Gln Val Т г
Phe G1y Ile !1е Ala Ье
Phe Gl Ile Ile Ala Ье
П р и м е ч а н и е. Верхние строчки: предшественник человеческого фНО, Нижние строчки: предшественник кроличьего фНО.
Участки, обведенные прямоугольником, являются гомологичным участком.
Обозначение " †-" показывает удаление аминокислоты, 33
Аминокислота Относительные молярные количества
Таблица 8
Доля ингибирования роста, Х
Клетки человека
Нормальные клетки:
WI-38 !
t (АТСС CCL 75) легочный диплоид (ATCC «CCL 171) легочный диплоид (ATCC ССЬ 186) легочный диплонд
Не ингибирует
Не ингибирует
Не .ингибирует
MRC-5
IMR-90
Опухолевые клетки:
G-361
НТ-1376 (АТСС СЫ 1424) меланома (АТСС СИ 1472) кар цинома мочевого пузыря (АТСС СИ 1500) кар цинома молочной железы (АТСС СШ 1543) остеогенная саркома (АТСС CCL 218) аденокарци,нома толстой кишки
f(АТСС НТВ 22) аденокарцинома молочной железы (АТСС CRL 1440) почечная лейомибластома (ATCC CRL 1469) эпителоидная карцинома (АТСС CCL 2) эпителоидная карцинома
49
ZR-75-1
H0S
WiDr
MCF 7
С-402
59
HeLà
Asp-Asn
Thr
Ser
Glu+Gln
Pro
Gly
Ala
Cys
Val
Met
Ile
Leu
Tyr
Phe
His
Ly s
Arg
Trp
Таблица 7, 12,1
5,5
12,4
20,3
10,3
10,6
13,0
1,5
12,1
0,1
8,0
17в7
6,8
3,9
2,8
6,1
7,5
1,6
5 1614 765 . 36
Таблица 9
10 20 30! 1 ) ССССССООСССССООСССТСТССАСАСАСС
40 50 60
) I I
GCCATGAGCACTGAGhGTATGATCCGGGAC
HetSerThrGluSerMetI1eArgAsp
70 80 90
СТССАССТСССОСАООООССССТССССААС
Ча1С1иЬеиА1аС1иО1уРгоЬеиРгоЬуз.
100 110 120
1 1 ) AAGGCAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAAGCGC
LysAl aGlyGl уProGl ïGlóSåгLysAr g
130 140 150
) I I
TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTG
CysLeuCysLeuSerLeuPheSerPheLeu
160 170 180
l I t
CTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC
LeuV a1Al aGly Al àÒh r Th r LeuPheCys
190 200 210
I Ф 1
CTGCTGCACTTCAGGGTGATCGGCCCTCAG
LeuLeu Hi s PheAr gVa1 I 1 eGly Pr oGl n
220 230 240
I 1
GAGGAAGAGCAGTCCCCAAACAACCTCCAT
С1иС1иС1иС1пЯегРгоАзпАзпЬеиН18
250 260 270:
I 1 ) CTAGTCAACCCTGTGGCCCAGATGGTCACC
LeuValAsnProValAlaGlnMetValThr
280 290 300
I ) I
CTCAGATCAGCTTCTCGGGCCCTGAGTGAC
LeuArgSerAlaSerArgAlaLeuSerAsp
310 320 330
) I I AAGCCTCTAGCCCACGTAGTAGCAAACCCG
LysРгоЬеиАlaHi зЧа17а1А1аАвпРго
340 350 360
1 ) ) CAAGTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTGAGC
G1nVa1GluGlyGlnLeuGlnTrpLeuSer
370 380 390
I I 1
САссстсссААссссстОстсссс .AcGGc
Gl nAгдА1а AsnAl аЬеиЬеиАlaAsnGló
37
38
16! ч 65
1
400 410 420
1 9 4 °
ATGhAGCYCACGGACRhCChGCTGGTGGTG.
MetLysLeuThrAspAsnGlnL
430 440 450
s еCCGGCCGACGGGCTGThCCTChTCThCTCC
ProAlaAspGlyLeuÒórLåаI1å TyrSer
460 470 480 е t I
CAGGTTCTCTTCAQCGGTCAhGGCTGCCGC
GlnValLeuPheSerGlyGlnGlyCysArg
490 500 510
I t I
TCCTACGTGCTCCTCACTCAChCTGTCAGC
SerTy rVa1LeuLeuThr Hi sThrValSer
520 530 540
Ф 1 t
CGCTTCGCCGTCTCCTACCCG AACMGGTC йгдРЬеИ.аЧа1$егТугРгойаиЬуьЧа1
550, 560 570 ! I 1
AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTQC
ЛйпЬенЬеи$егЛ1а11еЬузБегРгоСуз
580 590 600 ю Ф
CACCGGGRGACCCCCGRGGAGGCTGRGCCC
HisArgGluThrProGluG1 uAlaGluPro
610 620 630
I I I
ATGQCCTGGTACGAGCCCATCTACCTGGGC
NetAlaTrpTyrGluProI1eTyrLeuGly.
640 650 660 е 1 I
GGCGTCTTCCAGTTGGAGAhGGGTGACCGG
GlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArg
670 680 . 690
9 1 I
CTCAGCACCGAGQTCAACCAG CCTGAGTAC
Ьеи8егТЬгС1иЧа1ЛзпС1вРгоС1иТуг
700 710 720
В t I
CTGGACCTTQCCQAGTCCGGGCAGGTCTAC
Leu AspLeuAlaQl uSe r GlyGl nValTy r
730 740 750
° . Ф
TTTGGGATCATTQCCCTGTGAGGGQACTGA
PheGlyllelleAlaLeu
760 770 . 780
9 1 1
CCACCACTCCTCCCCCTCTCÑCACÑÑCAGC
790 800
1 1
CCCCTCACTCTGQGCG CCCTCAG
39
161476
Получение и-РНК ФНО иэ человеческих альвеолярных макрофагов, Человеческие альвеолярные макрофаги собирают бронхо-альвеолярным промы5 ванием с помощью фосфатного солевого буфера. Альвеолярные макрофаги, 6,3 10 клеток, суспендируют в среде
RFMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) при концентрации клеток 9 ° 10 клеток на чаш6 ку. Их предварительно культивируют при 370С в полностью влажной атмосфере, содержащей 5 углекислого газа.
Через 1 ч культивирования эндотоксин (липополисахарид, полученный из
E.coli), TPA (форбол-12-миристат-13-ацетат) и циклогексимид (ингибитор синтеза белка) добавляют в чашки та- 20 ким образом, чтобы их результирующие концентрации стали равны 10 мкг/мл, 10 нг/мп и 1 мкг/мл соответственно.
После этого культивирование продолжают проводить еще в течение 4-4,5 ч 25 (общее время 5-5,4 ч). Культуральную сраду удаляют отсасыванием, и макрофаги, адгеэированные к чашкам, лизируют и гомогенизируют в 5 М гуанидилтнбцианатном растворе, содержащем 30
0,6 N-лауроилсаркозината натрия и
6 мМ цитрата натрия. Гомогенизат заг" ру4:ают в 5,7 M раствор хлорида цезия, содержащий О, 1 М ЭДТУК, и центрифугируют в течение 20 ч при 26500 об/мин с использованием ультрацентрифуги с получением общей фракции 1 НК в форме гранул. Гранулы растворяют в небольшом количестве 7 М раствора мочевины, содержащего 0,35 M NaCl, 20 мМ 4р трис-НС1 (рН 7,4) и 20 мМ ЭДТУК, и выделяют осаждением из этанола, Получают
159 . ;кг общей РНК, Фракцию общей PHK растворяют в
1 мл 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), буфера., 45 содержащего 1 мМ ЭДТУК (обозначается как ТЗ-раствор) и раствор нагревают о„
Э гри 65 С в течение 5 мин. Добавляют ра<:твор хлористого натрия до результирующей концентрации 0,5 М, и раствор 50 наносят на колонку олиго(,Т)-целлюлозой, предварительно приведенной в равновесное состояние по отношению к
ТЭ-раствору, содержащему 0,5 М хлористый натрий, Поли(А)-и-PHK элюируют из 55 колонки с помошью ТЭ-раствора и полу-* чают 8 мкг
Папи(А)-и-Р11К растворяют в концентрации 1, 9 нг/нл в дистиллирован40 ной воде и раствор инъектируют в ооциты Xenopus laevis в дозе приблизительно.50 нл на ооцит способом микроинъекции, Десять ооцитов инкубируют в
100 мкл среды Barth при 22 С в течение
24 ч. Ооциты гомогенизируют и центрифугируют при 10000 об/мин в течение
10 мин. Супернатант подвергают анализу на ФНО-активность определением ци" тотоксической активности по отношению к клеткам: L-929 мыши, Способ измерения цитотоксической активности по отношению к клеткам
L-929 является следующим.
Образец (0,1 мл) серийно разбавляют указанной ниже средой и в каждую лунку пластинки с 96 лунками прибавляют О, 1 мл суспензии клеток L-929 (5 10 клеток/мл), содержащей актиномицин D (2 мкг/мл), Используют минимальную питательную среду Eagle содержащую 1% эмбриональной бычьей сыворотки. Пластинку инкубируют при
38,5 С в течение 18 ч в полностью . о влажной атмосфере, содержащей 5 углекислого газа, Методики определения числа жизнеспособных клеток L-929 и оценки биологической активности являются такими же, как методики анализа на цитотоксическую активность с использованием клеток L-М в качестве клеток-мишеней.
Цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-929, определенную в указанных выше условиях, выражают как единицы (L-929) для того, чтобы отличать ее от цитотоксической активности по отношению к мышиным клеткам Ь-М.
Супернатант, полученный так, как описано выше, обладает цитотоксической активностью 6,6 единиц (1.-929) на 1 мп. Это указывает на то, что образец поли(А)-и-PHK содержит и-PHK
ФНО, Синтез к-ДНК.
Комплементарную ДНК синтезируют с использованием полученной поли(А)-и-РНК в качестве матрицы, 6 мкг поли(А)-и-PHK растворяют в
40 мкл буф:"ра 50 мМ трис-НС1 (рН8,3), содержащего 10 мМ MgC1<, 10 мМ дитиотреитола, 4 мМ пирофосфата натрия, 1,25 мМ каждого из трех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, дГТФ, дАТФ и дТТФ, 0,5 мМ дЦТФ, 167 нМ альфа- Р-дЦТФ (удельная радиоактивно Tb
161476
3000 Ci (ммоль), 4 мкг олиго (дТ) и
120 единиц обратной транскриптазы, лолученной из вируса птичьего миелобластоза птиц (ВПМ?, и инкубируют при
43 С в течение 30 мин, После этого реакцию останавливают прибавлением
ЭДТУК. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол — хлороформ (1:1) и к водной фазе прибавляют ацетат аммо- !0 ния до результирующей концентрации
2,5 М. Результирующий гибрид к-ДНК-и-PHK выделяют из водной фазы осаждением из этанола. Осадок гибрида к-ДНК;и-РНК растворяют в 10 мкл 20 мИ буфе-!5 ра трис-НС1 (рН 7,5), содержащего 5 мМ
МдС1, 10 мМ сульфата аммония, 100 мМ хлористого калия, О, 15 мМ бетаникотинамидадениндинуклеотида, 5 мкг бычьего сывороточного альбумина, 20
0,04 мМ каждого из четырех дезоксирибо нукле отид трифо сфато в, д ГТФ, дАТФ, дТТФ и дЦТФ, 0,9 ед, рибонуклеазы Н.
Е. cali и 23 ед. ДНК-полимеразы I, IE. coli и инкубируют при 12 С в тече- 25 ние 60 мин, а затем еще в течение
60 мин при 22 (. для синтеза днк-ДНК.
Реакцию останавливают прибавлением
ЭДТУК, днк-ДНК экстрагируют смесью фенол — хлороформ и выделяют осаждением 30 из этанола.
Получение к-ДИК с олиго(дЦ)-окончанием. днк-ДНК растворяют в 100 мкл
100 мМ буферного раствора какодилата натрия (рН 7,2), содержащего 2 мИ .СоС1, 0,2 мМ дитиотреитола, 0 1 мИ
92 р»
1 t, альфа- Р-дЦТФ (удельная радиоактивность 3 Ci (ммоль) и 10 единиц терминальной дезоксинуклеотидилтрансфера- 40 зы, и инкубируют при 37 С в течение
30 мин для достижения присоединения окончаний олиго(дЦ) к 3-окончаниям днк-ДНК, Реакцию останавливают прибавлением 45
ЭДТУК днк-ДН К, оканчивающуюся олиго (дЦ), экстрагируют смесью сренол — хлоpomopM и выделяют осаждением из этанола днк-ДНК, оканчивающуюся олиго(дЦ), растворяют в 10 мМ буфере трис-НС1 50 (рН 7,4), содержащем 1 мИ ЭДТУК и
100 мМ хлористый натрий, с получением результирующей концентрации днк-ДНК, оканчивающейся олиго(дЦ), равной
2 мкг на 1 мл ° 55
Получение ДНК рВК 322, оканчивающейся олиго (дГ) .
10 мкг ДНК pBR 322 растворяют в
100 мкл 20 мМ буфера трис-НС1 (рН
5 4 >
7,4?, содержащего 1О мМ хлористстс магния, 50 мМ сульфата аммония и !
О кг бычьего сывороточного альбумина, и прибавляют 15 единиц рестрикционной эндонуклеазы Pst I, Смесь инкубируют при 37(С в течение 1 ч. После окончания реакции реакционную смесь экстрагируют смесью фенол — хлороформ и результирующую ДНК выделяют из водной фазы осаждением из этанола, Полученную ДНК растворяют в 200 мкл такого же буферного раствора, который был использован выше, для присоединения к окончанию днк-ДНК (за исключением того, что он ñодержит 80 единиц терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и Н-дГТФ вместо
3ZP — дЦТФ) и инкубируют при 37 С в течение 20 мин, осуществляя присоединение приблизительно 10-15 остатков дезоаксигуанидиновой кислоты (дГ) к
3 -окончаниям. Реакционную смесь экстl рагируют смесью фенол — хлороформ и ДНК.
pBR 322, оканчивающуюся олиго(дГ), выделяют из водной фазы осаждением этанолом, Результирующую ДНК pBR 322 с присоединенными окончаниями растворяют в том же буфере, какой был использован для растворения олиго(дЦ)концевой днк-ДНК таким образом, чтобы результирующая концентрация ДНК pBR
322 с присоединенными окончаниями была равна 20 мкг/мл, Конструирование рекомбинантных плазмид.
120 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой к-ДНК смешивают:.. равным объемом раствора олиго(дГ)-концевойДНК pBR322 и смесь инкубируют последовательно при 65 С в течение 5 мин и при
57 C в течение 120 мин для достижения ренатурации и конструирования рекомбинантных плазмид.
Отбор организмов-хозяев, С помощью полученных выше рекомбинантных плазмид трансформируют штамм
E ° ño1i Õ 1776.
Е.coli Х 1766 культивируют при
37 С в 20 мл L-(>ульона (состав: 10 г триптона, 5 r дрожжевого экстракта, 5 r хлористого натрия и г глюкозы на 1 л; рН 7,2?,содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты и40 мкг/мл .тимилина, до тех пор, пока мутность, измеряемая при 600 нм, не достигнет
0,5. Клетки собирают центрифугированием при 4 (;, промывают 10 мл 10 мМ буфера трис-НС! (рН 7,3), содержащего
43
44
1614765
50 мМ хлористый кальций. Клетки снова суспендируют в 2 мл того же буферного раствора и оставляют стоять при 0 С в течение 5 мин К 0,2 мл суспензии прибавляют О, 1 мл раствора рекомбинантных плазмид. Смесь оставляют стоять при О С в течение 15 мин и затем выдерживают при 42 С в течение 2 мин, ° о
Затем прибавляют 0 5 мл L-бульона с добавками, проводят культивирование при встряхивании в течение 1 ч, Отби-. рают аликвоту культуры, наносят на пластинку агара с L-бульоном, содержащим добавки, содержащую тетрациклин в 15 концентрации 15 мкг/мл, и культивируют при 37 С в течение приблизительно
12 ч. Набор к-ДНК получают отбором трансформированных клеток, устойчивых, к тетрациклину, 20
Клонирование к-ДНК человеческого
ФНО.
Трансформированные клетки, включаю-., щие в себя рекомбинантные плазмиды, содержащие к-ДНК, кодирующую полипеп- 25 тид человеческого ФНО, отбирают из набора к-ДНК гибридизационным анализом с использованием фрагментов ДНК, .полученных из клонированной к-ДНК, кс-. дирующей кроличий ФНО, в качестве 30 пробы, к-ДНК, кодирующую кроличий ФНО, выделяют из рекомбинантной плазмиды рК ТИР 802, Последовательность оснований представлена в табл, 3. .Расщеп- 35 ляют рестрикционной эндонуклеазой
Na I или Нае II. Отщепленные фрагменты ДНК выделяют осаждением из этакола, Их подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле для выделения 40 целевых фрагментов ДНК.
Фрагмент ДНК (299 п.о,)„ соответствующий основаниям от 285 до 583р как показано в табл. 3, получают расщеплением рестрикционной эндонуклеазои
Ava I (обозначают как Ava I-фрагмент).
Другой фрагмент ДНК (88 п,а,), соответствующий основаниям от 33 до 120, как показано в табл, 3, получают расщеплением с помощью рестрикционной
50 эндонуклеазы Нае ХХ (обозначают как
Нае II-фрагмент). Ava I-фрагмент и Нае 1I-фрагмент метят радиоактивной меткой 1 . Эти меченные фрагменты
ДНК используют в качестве пробы для проверки набора к-ДНК и отбора трансформированных клеток, имеющих плазмиду, содержащую к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО, колонарным гибридизационным анализом в соответствии с методикой Hanahan u
Neselson.
С использованием P-меченного
32
Ava I-фрагмента в качестве пробы при первом отборе из приблизительно
20000 клонов выбирают 43 клона, Кроме того, эти 43 выбранных клона подвергают второму отбору с использова вием Р-меченного Hae II-фрагмента
32 в качестве пробы, С помощью этих анализов отбирают
6 клонов, имеющих;>екомбинантные плаэмиды, сильно гибридизующиеся к-ДНК, с помощью обоих фрагментов к-ДНК кроличьего ФНО.
Экспрессия.
Выделяют ДНК рекомбинантной плаэмиды из 6 трансформированных организмов, а именно: плазмиды N pHTNF 1, pHTNF 4, pHTNF 5, pHTNF 13, pHTNF 22 и pHTNF 26 соответственно, Каждую из рекомбинантных плазмид вводят в Е.coli HB101 для получения трансформированных организмов, содержащих рекомбинантные плазмиды.
Трансформированные клетки культивируют в 50 мл LB-бульоне (состав:
10 г триптона, 5 r дрожжевого экстракта и 10 г хлористого натрия на
1 л; рН 7,5) до тех пор, пока мутность культуры, измеряемая при 600 нм, не достигнет приблизительно 0,8. После этого собирают приблизительно 3-5 II х 10 клеток, Клетки лизируют с неболь о шими модификациями методики, Клетки суспендируют в 1 мл 50 мМ буфера трис-НС1 (рН 8,0), содержащего О, 1Х лизоцима и 30 мМ NaCl. После выстаивания в течение 30 мин в ледяной воде клетки подвергают лизису шестикратным замораживанием-размораживанием. Клеточные остатки удаляют центрифугированием и получают просветленный лизат, Лизат, полученный из каждого трансформированного организма, подвергают анализу на цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-929.
Было установлено, что лизат, полученный из трансформированного организма, содержащего плазмиду pHTNF 13 имеет цитотоксическую активность
186,1 единицы (L-929)/мл.
Определение последовательности оснований в клонированной к-ДНК.
Рекомбинантную плазмиду pHTNF 13 выделяют так, как описано выше. Плаз.-.
46
1614765 мидную ДНК расщепляют с помощью рестрикционной эндонуклеазы Рзt I и выделяют клонированную к-ДНК, введенную в вектор. После этого фрагмент клонированной к-ДНК расщепляют различными рестрикционными эндонуклеазами, и последовательности оснований, результирующих 16 фрагментов, определяют по методике Maxam-Gilbert с использова10 нием клеток 1, †9 в качестве клетокмишеней. Кроличий плазменный ФНО предварительно разбавляют фосфатным солевым буфером и разбавленный раствор используют в качестве контрольного об15 разца ФНО. Как показывают представленные результаты (см. табл. 10), цитотоксическая активность полипептида человеческого ФНО не нейтрализуетсяантителом.
Таблица 10
Образец
Цитотоксическая лнтитело против кроличьего. плазменного ФНО
25 ность единиц (1 -929) /мл
186, 1
Не добавлялось.
Лизат из трансформированного организма, содержащего плазмиду
pHTNF 13
Кроличий плазменный
ФНО
Добавлялось 191,0
Не добавлялось 572,3.
Добавлялось (0 1
Цитотоксическая активность показана как активность в растворе первоначального образца, используемом для испытания.
Пример 5.
Получение полипептида человеческого ФНО в Escherichia coli, Экспрессия под контролем промотора ас.
Клонированную к-ДНК вьщеляют из рекомбинантной плазмиды рНТИР 13. к-ДНК затем расщепляют с помощью рестрикционной эндонуклеазы Есо К Т для отщепления части некодирующего участка ниже участка, кодирующего ФНО. Результирующий фрагмент ДНК (приблизи- 55 . тельно 1,1 т,п.о.) вводят в больший фрагмент ДНК, полученный из плазмиды
pBR 322, расщеплением рестрикционными эндонуклеазами Pst I и Есо R IH конструируют рекомбинантную плазмиду, включающую в себя к-ДНК ФНО и ген устойчивости к тетрациклину,.называемый рНТ 113. к-ДНК, выделенную из рНТ 113, расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Ava I u Hind III и результирующий фрагмент ДНК (578 п.о,), включающий в себя большую часть участка, кддирующего полный полипептид человеческого ФНО (называемый ЧФНО-фрагмент), выделяют с помощью электрофореза на полиакриламидном геле.
Фрагмент ДНК, включающий в себя участок промотора tac, вьщеляют следующим образом. Плазмидную j(HK (300 мкг/рИ 540) растворяют в ? мл
10 мМ буфера трис-НС1 (pH 7,5), содержащего 50 мМ NaC1, 6 мМ МяС1 и 6 мМ
2-меркаптоэтанол, и расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Есо R I .и Вага HI инкубированием при 37 С в течение 60 мин. После добавленггн хлористого натрия до результирующей концентрации 0,3 М отщепленные фрагмен- ты ДНК выделяют из этанола, Фрагмент
ДНК, включающий в себя участок промотора г:ас, выделяют электрофорезои на полиакриламидном геле с выходом
8,3 мкг.
Фрагмент промотора сас связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонуклеотидным адаптором, представленным следующей формулой:
5 -САТССАТСТСАТСТТСТССАЛСС
3 -GTACAGTAGAAGAGCTT",GGGÑÒ
Этот адаптор включает в себя инициирующии кодон ATG и последовательность оснований соответствующую
-(Э
5 -концевой части последовательности оснований, кодирующей полный полипептид человеческого ФНО, и имеет
8am III â и Ava I - когеэивные концы, Резу: ьтир.ющии фрагмент ДНК называют
tac — промотор-адапторпым фрагментом.
Отдельно больший фрагмент ДНК (приблизительно 4,3 т.п,о.), включающий в себя ген устойчивости к ампициллину (называемый фрагментом pBR 322-Амп" вырезают из плазмиды pBR 322 расщеплением рестрикционными эндонуклеазами Hind III и Есо R I и вьщеляют гель-электрофорезом с использованием агарозы (0,7%) с низкой температурой размягчения.
1 мкг ЧФНО-фрагмента и 6 мкг фрагмента pBR 322-Амп растворяют в 66 мМ з
1614765 буфере трис-НСl (рН 7,6), содержащем
6,6 мМ хлористый магний, и инкубируют при 550С в течение 10 мин, После этого прибавляют АТФ и дитиотреитол, соответственно до концентраций 1 и
10 мМ, прибавляют 168 единиц Т ДНК-лигазы и смесь инкубируют при 22 С в течение 120 мин. Результирующий фрагмент ДНК выделяют экстракцией фенолом и получают приблизительно 4 мкг, Фрагмент ДНК (0,8 мкг) связывают с
tac-промотор-адапторным фрагментом (0,3 мкг) в тех же условиях, как описано выше, за исключением того, что используют 63 единицы Т4 HK-лигазы.
Реакционную смесь разбавляют в 6 раз дистиллированной водой и смешивают с равным объемом суспензии клеток . Е,coli П4103/Р-Ч, обработанной каль- 20 цием.".ледующим образом. Смесь после. довательно инкубируют в ледяной воде в течение 20 мин, при 42 С с течение
1 мин и при комнатной температуре в течение 10 мин и прибавляют бульон 25
ЬВ. Смесь встряхивают при 370С в течение 60 мин. Аликвоту результирующей клеточной .суспензии наносят на ЬВ-агаровые пластинки, содержащие ампициллин в концентрации 25 мкг/мл, и куль- 30 тивируют в течение ночи при 37оС. Отбирают колонии, устойчивые к ампициллину, Один из трансформированных организМоВ> способный вырабатывать полипептид человеческого ФНО, бып назван .ХМ1 03 / рНТТ26 .
Обработанные кальцием клетки Е.coli
IM103 получают следующим образом.
Клетки Е.coli ТМ103 высевают в L-бульс.н и культивируют при 37 С в течение ночи. 1 мл результирующей культуры высевают в 100 мл ЬВ-бульона и.дополнительно культивируют при 37 С до тех 4 пор, пока мутность культуры, определяемая при 650 нм, не достигнет 0,6.
После выстаивания в течение 30 мин в ледяной воде к етки собирают центрифугированием и суспендируют в 50 мл
50 мМ раствора хлористого кальция,, после чего выдерживают при О С в тео, чение 60 мин,Клетки собирают центрифугированием и снова суспендируют в
10 мп 50 мМ раствора хлористого капьция, содержащего 20% глицерина, и
55 эту суспензию используют в качестве обработанной кальцием суспензии клеток Е.cali ТМ103.
Трансформированный организм
IM103/рНТТ26 культивируют в течение о ночи в бульоне LH при 37 С, Культуру (0,5 мп) высевают в 5 мл свежего бульона ЬВ и дополнительно культивируют при 3700 в течение 1 ч. После этого прибавляют изопропил-бета-D-тиогалактозид до результирующей концентрации
1 мМ и культивирование продолжают еще в течение 4 ч, Клетки собирают и суспензируют в 1 мл 50 мМ буфера трис-НС1 (pH 8,0), содержащего 0,1% лизоцима и 30 мМ NaCl и ос; являют стоять при
0 C в течение 30 мин. После этого шесть раз повторяют замораживание в смеси сухой лед — этанол и размораживание при 37 С, клеточные остатки удаляют центрифугированием и получают просветленный лизат.
Лизат имеет цитотоксическую активность, равную 99000 единиц (Ь-929)/мп..
Эта цитотоксическая активность не нейтрализуется антителом против кроличьего плазменного ФНО, Это подтверждает тот факт, что полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересекается с кроличьим плазменным ФИО.
Экспрессия под контролем промото"
pa trp °
Рекомбинантную плазмиду рНТ 113 разлагают рестрикционными эндонуклеазами Ava I u SaI I для расщепления на 3 фрагмента (размером приблизительно 0,8, 1,3 и 2,6 к.п,о.). .Фраг" мент 1,3 к.п,о. — ДНК, включающий в себя большую часть участка, кодирующего полный полипептид человеческого
ФНО и часть гена устойчивости к тетрациклину выделяют (обозначают как
Ava I — SaI I-фрагмент) Ava I — SaI 1фрагмент связывают со слеДующим.химически синтезированным олигодезоксирибонуклеотидным адаптором. Этот адаптор обозначают как адаптор Т
5 — ССАТАТСТСАТСТТСТССААСС.
3 -YATACAGTAGAAGACCTTGGGGCT
Результирующий фрагмент ДНК обозначает как ЧФНО-адапторный фрагмент. (Отдельно фрагмент ДНК (35 п.о.), включаюп; и в себя часть участка промо-тора trp> отрезают от плазмиды
pDR 720/P-L расщеплением рестрикционными эндонуклеазами Есо К Х и Нра I, и фрагмент ДНК связывают с химически синтезированным адаптором, имеющим следующую формулу;
49
I 6 I
5 - AACTACTAC(-CAAGTTCACGTAAAAAGGGTAAT
TTGATCATGCGTTCAACTGCATTTTTCCCATTAGC
Связанный фрагмент(т ДНК обозначают как фрагмент промотора trp.
Плазмиду рВК 322 расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Есо К Т и
SaI I и выделяют больший фрагмент ДНК (приблизительно 3,7 к.п,о,). Последовательниц связыванием этих трех фрагментов ДНК, Фрагмента ЧФНО-адаптора, фрагмента промотора trp и большего фрагмента pBR 322 конструируют экспрессивную плазмиду pHTR 91. Экспрессивную плазмиду вводят в клетки
Е.coli HB101 способом, и один из трансформированных организмов называют НВ101/рНТК 91, .
Трансаормированный организм
HB101/рНТР 91 культивируют в течение ночи при 37аС в модифицированной среде М-9 (состав: 0,7i: Na
0,3/ КН РО+, .0,05i. NaC1; О, 1i ИН С1;
2 мг/мл витамина В, 0,45% казаминовой кислоты, 1 мМ MgSO<, 0,1 мМ СаС1 и 0,5% глюкозы), Культуру (0,05 мл) высевают в 5 мл той же самой среды и культивируют при 37 С в течение I ч.
После этого прибавляют 3-бета-индол30 акриловую кислоту до результирующей концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение 4 ч, Клет. ки собирают и обрабатывают по описанf ной методике и получают просветленный лизат. 35
Лизат имеет цитотоксическую активность 1,01 ° 10 единиц (L-929) на
1 мле
Экспрессия под контролем промото:ра phoS.
Полученный фрагмент Ava I — SaI I связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонуклеотидным адаптором имеющим следующую последовательt
45 ность:
5 -CATCCATCTCATCTTCTCCAACC
3 -СТАСАСТАСААСАССТТССССССТ
Связанный фрагмент ДНК расщепляют рестрикционной эндонуклеазой Bam Н I и получают фрагмент ДНК, имеющий на обоих окончаниях когезивные концы
Bam H I (обозначают как фрагмент
ЧФНО-Тет Ваш Н I) .
Отдельно плазмиду рБИ 5182, содержащую ген phoS,: расщепляют рестрикционной энцонуклеазой НрА I u
Есо К I и получают фрагмент ДНК (приблизительно 4 к.п.о.), включающии в себя участок промотора phos и пос-. ледовательность ЯЫпе-l)algarno, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид и И-концевую часть связывающего фосфат белка, а также ген устойчивости к тетрациклину, Этот арагмент ДНК обозначают как фрагмент Нра 1 — Есо R.I. Фрагмент
Нра I — Есо R I связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидом-связывателем, имеющим следующую последовательность:
5 -СССЫ:АТССЫИС ,с
-3 -GGGCCTAGGCCC
После этого связанный фрагмент
ДНК расщепляют рестрикционной эндо- . луклеазой Вата Н I. Результирующий врагмент ДНК (приблизительно
3,6 к.п.о,), имеющий когезивные концы Bam Н Т на обоих окончаниях, обозначают как фрагмент промотор Phos
Ham Н I Хет".
Фрагмент ЧФНО-Тет, Ваш Н I связы, Ч вают с фрагментом Ilpомотор Phos
Ьап Н I. Тет " и конструируют экспрессивную плазмиду для получения полипептида человеческого ФНО, связанного со связывающим фосфат белком, которую называют pHTS 115. Экспрессивную плазмиду вводят в Е.coli НВI01 по вышеописанной методике, Одним из трансформированных организмов (HB101/pHTS 115) культивируют в 5 мл среды TG (состав: 120 мМ буфер трис-НС1, рН 7,4, содержащий 0,27. глюкозы, 80 мМ NaC1, 20 мМ КС1, 20 иМ ИН l, 3 мМ !а S0<, 1 мМ
MgCl<, О, 2 мМ СаС1, 200 нМ ГеС1, 20 мг/л лейцина, 20 мг/л пролина и
10 мг/л витамина В1), в которой при-.. сутствует l
