Способ хемотаксономической идентификации шигелл флекснера и эшерихий

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для таксономической идентификации /семейственно-родовой и видовой/ семейства ENTEROBACTERIACLAE, вч шигеля и эшерихий и их половых гибридов. Целью изобретения является повышение точности за счет выявления половых гибридов шигеля и эшерихий и упрощение способа. Способ заключается в том, что из изучаемых клеток бактерий выделяют клеточные фосфолипиды, осуществляют их фракционирование, определяют содержание фосфатидилэтаноламина и дифосфатидилглицерина и используют индикационно-диагностический коэффициент /КИДК/-K четности жирных кислот, K биосинтеза циклопропановых жирных кислот, K изомеров разветвленных жирных кислот. K четности ЖК=четн.ИСК/нечет.ЖК

K биосинтеза ЦЖК=C<SB POS="POST">16:1</SB>+C<SB POS="POST">17:0</SB>/C<SB POS="POST">18:1</SB>+C<SB POS="POST">19:0</SB>

K изомеров РЖК=IC<SB POS="POST">15:0</SB>/IC<SB POS="POST">17:0</SB>+AC<SB POS="POST">17:0</SB>

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) ((1) (gg)g С 12 N 15/00 ", ЯЗМп,;..: Л1ь В3 Э; =

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К А8ТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ четн. ИСК, нччет. КК

К четности =

ЖК

С16: 4 + С17 0

К биосинтеза

ЦЖК

18:1 19: О

iC (g;p

К изомеров

РЖК

)-Сл..о + «iy p

1 (21) 4291539/30-13 (22) 28,07,78 (46) 23.10.90. Бюл. И - 39 (71) Владивостокский государственный медицинский институт (72) H.Ñ.Ìîòàâêèíà и Т.К.Каленик (53) 575.224.2 (088.8) (56)Васюренко 3.П., Синяк К,М. Известия АН СССР. Сер. биологическая, 1976, - 3, с. 410-412.

Андреев А.В., Гальченко В.Ф. Тезисы докладов II Всесоюзной конференции. — М., 1979, с. 31-34. (54) СПОСОБ ХЕМОТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШИГЕЛЛ ФЛЕКСНЕРА И ЭШЕРИХИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для таксономической идентификации (семейственно-родовой и видовой ) се.мейства Entегоbacteriaceae, в частности, шигелл и эшерихий и их половых гибридов. Целью изобретения является

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для таксономической идентификации (семейственно-родовой и ви- довой) атипичных и типичных представителей ce eAcxaa Entегоbacteriaceae, в частности шигелл и эшерихий, а также их половых гибридов.

Цель изобретения — повышение точности за счет выявления половых гибридов шигелл и эшерихий и упрощение способа, В качестве хемотаксономических маркеров используют особенности качественно-количественной характерис-

2 повышение точности за счет выявления половых гибридов шигелл и эшерихии и упрощение способа. Способ заключается в том,что иэ изучаемых клеток бактерий выделяют клеточные фосфолипиды, осуществляют их фракционирование и определяют содержание фосфатидилэтаноламина и дифосфатидилглицерина и используют индикационно-диагностический коэффициент (КИДК) — К четности жирных кислот, К биосинтеза циклопропановых жирных кислот, К изомеров разветвленных жирных кислот. тики жирнокислотного состава наиболее массивных и эволюционно значимых фосфолипидов энтеробактерий — фосфатидилэтаноламина, дифосфатидилглицерина и используют индикационно-диагностический коэффициент (КИДК)

К чети.жирных кислот, К биосинтеза ЦЖК (циклопропановых жирных кислот), К иэомеров РЖК С, -С,7 (разветвленных жирных кислот).

Пример 1. Генетическую родо- . вую рекомбинацию проводят с использованием в качестве реципиента (F )Sh.flexneri )(- 737 тип 2а, грамотрицателен, неподвижен, дает потомство

1601119

35 в кроссе с фертильноактивными эшерихиями (1 ), устойчив к с TpBIITQMHIJHHó г (Str ), чувствителен к антибиотикам мономицину и неомицину (mon, пео ), лактозу не ферментирует (Lac ), ви5

1 рулентеп,?Л о для белых беспородных мы шей составляет 110,47 мпн микробных тел.

Донором служит (F ) Е.coli HfrH

| (Я) — грамотрицателен, в кроссах с 10 реципиентом шигелл Флекснера дает высокую частоту генетических рекомбинатов, подвижен, перитрих„ чувствителен к стрептамицину (Str ) „ устойчив

5 к антибиотикам мономицину и неоми- 15

1 1 цину (mon, пес ), обладает высокой ферментативной активностью в отношении лактозы (LBc ), не вирулентен

+ (Щ ) . для беспородных белых мьш|ей больше 10000 млн микробных тел. 20

Половые гибриды (генетические рекомбинаты) шигелл Флекснера и эшерихий представляют собой штаммы:

R-737-2, R-737-4, R-737-6. Они имеют одинаковые. биологические характерис- 25 тики: грамотрицательны, неподвижны, устойчивы к стрептомицину, стрептомицину Str, иономицину mon нео Ъ р

У мицину пео, отличаются активностью в отношении к лактозе. Последнее используют вместе со стрептомицин30 реэистентностью как важный селективHbIA признак для отбора рекомбинантов, ,Это позволяет избежать влияния жир(нокислотного состава питательной ( среды на ростовые характеристики штаммов и жирнокислотный состав андо генных липидов, Наилучшим способом ростижения стабильности жирнокислотного состава бактерий служит их мно гократное пассажирование. В опытах с

40 этой целью используют межродовую генетическую рекомбинацию. По вирудентности половые гибриды следуют за реципиентной культурой: для белых беспородных мышей LP составляет

133,47 млн микробных тел.

Г>иомассу бактериальных культур

Выращивают на стандартных плотных средах МПЛ одной серии изготовления.

Отмыв культуры от остатков среды про- 50 изводят раствором натрийхлорида с массовой долей 0,50% до отрицательной реакции с нингидридом.

Экстракцию клеточных липидов производят из убитой ацетоном и лио- 55 филированной биомассы культур методом Фолча, Клеточные липиды хранят в смеси хлороформ — метанол в отношении 2/1 (V/V) в стеклянных пробирках с притертыми пробками при -20 С.

Антиоксиданты не добавляют.

Липидную природу выделенных фракций подтверждают и с помощью инфракрасных спектров. Идентификацию полос поглощения в ИК-спектрах проводят известными методами. ИК-спектры образцов липидов определяют в диапазоне 400-4000 см в виде жидких пленок на подложке из калийбромида.

Для идентификации классов фосфолипидов применяют универсальные фосфорномолибденовый реактив, специфические реактивы на функциональ ные группы. В качестве стандартов используют коммерческие фосфолипиды. Фосфор в целых липидах и во фракциях определяют согласно руководству M,Êåéòñà. Для получения моноеновых жирных кислот фосфатидилэтаноламины подвергают кислому метанолизу.

Полученные экстракты очищают тонкослойной хроматографией -на силикагеле марки КСК в системе: петролейный— диэтиловый эфир, (V/V) 19:1. Качественно-количественную характеристику жирных кислот получают при использовании газожидкостной хромато графией при условиях: стеклянная колонка 5 м х 1 мм, чувствительность

2 «10, температура колонки 2?О С о

Э испарителя +300 С, подвижная фаза

3% SP 1000, размер зерен 50-80 меш, в качестве внешних стандартов используют набор жирных кислот, Хроматомассоспектрометрию жирных кислот ведут на масс-спектрометре, используя колонку с 3% Sp-10000 в изотермическом режиме (+220 С).

Спектроскопическое изучение жирных кислот производят методом НЯМР на

1 высокочастотном ЯМР-спектрометре при следующих условиях: внутренний стандарт — гептаметилендисилоксан, растворитель — диейтерированный хлороформ, частота 80 мрц,. темперао тура +25 С, в интервале -шкалы от -5 до +12,5 м.д.

Для всех изученных культур рассчитывают К четн. ЖК, К биосинтеза ЦКК и К изомеров РЖК С, -С 17. Производят статистическую обработку цифровых данных.

Качественно-количественные характеристики жирнокислотного состава фосфатидилэтаноламинов генетических рекомбинатов приведены в табл. 1

Таблиц ° 1

Культура

Сравнительная качественно-количественная характеристика культур

Качество хирных кислот

МоноеКоэффициенты внрных кислот

Г

К четности

Ненлентифицироввнные

Циклопропановые

Пиклопропвновые н нх бносинтетическ предшественники

Разветвленные аэветнные новые е нные

Чс + ь С«. ° чссз., + ь С>ь;1 тс о+ С» > о )СК чети

>„,, с„,, с„., c„,,*к

E.coif HfrH (донор)

Sh flexneri

737 тнп 2а (реципнент)

Генетические рекоибиивтзс

80>50 0>00

3,50 14,20

1,80

tf,ОО 3,20

3,5 1,О0 3,34

24,30 15,30

25,10 13,30

35>20 26,30

67,30 3,00

0,00

1>6

2,60

4 ° 46

21>10 8>20 2,5

6,50 26,30 0,00

0,80 1 35

H р и и е ч в н н е. Статистическая обработка результатов производилась с учетом r-распределения СтьксцентаФниера, расчетом средних величин и оиибок ° измерений достоверности основньос н сравянтельньпс показателей, су>ечнроввны средние значения статистических показателей измерений при P c 0,001.

Т а б л н ц а 2

Культура

Сравнительная качественно-количественная характеристика культур

Качество кирных кислот

Коэффициенты хирных кислот1 звег

Немце тифицнрован

ЦиклоЦиклопропановые и нх бкосинтетически предиественннки

Разветвленные

Моноеновые

K четности енные прона новые

С,т.a + ЧС>з,o + ЧС .о+ С» iC i e I ХК чети.

+ c«i>, + С,в,, ЧС,ч o+ С,в>, сСп.,+ вСп o ISIS кечетн и:>

E.coll HfrH (донор)

Sh. f 1 exneri (реципиеит), Генетические рекоибкввтзс

83,60 1,90

4,80 8,60

0>5

7,2 3,30 2,18 .0,52 4,32

33,70 6,70 52,70

1>0

1,70

6,90.

6 80

6 ° 80

0,73

t,З0 4,5

68 ° 50 1,00 24>20

6,20

1,30

5,90

1,20 l, 78

5 1бО и дифосфатидилглицерина генетических рекомбинатов и исходных культур — в табл. 2.

На основании особенностей жирнокислотного состава фосфолипидов сос .тавлена табл. 3, суммирующая результаты идентификации половых гибридов шигелл и эшерихий типичных исходных культур. Различия в жирнокислотных показателях, определяемых в предлагаемом способе, позволяет достаточно надежно отдифференцировать природные аналоги генетических рекомби натов шигелл и эшерихий.

Использование предлагаемого способа хемотаксономической идентификации гибридов шигелл Флекснера и эшерихий и исходных культур с использованием коэффициентов жирнокислотного состава ФЭ и ДФГ обеспечивает по сравнению с известными способами повышенную стабильность и эффективность хемотаксономических критериев, что достигается закреплением особенностей ЖК состава путем .генетической рекомбинации и введением дополнительных коэффициентов, учитывающих

1119

6 биосинтетические особенности циклопропановых, моноеновых и иэомеров разветвленных жирных кислот, поэтапную типизацию энтеробактерий и их

5 гибридов, что достигается разработкой схемы типизации, а также надежность используемых критериев, что достигается эволюционной значимостью фосфолипидов и статически выявленными достоверностями в уровнях изучаемых показателей.

Формула изобретения l5

Способ хемотаксономической идентификации шигелл Флекснера и эшерихий, включающий выделение клинических изолятов, посев, культивирование и на2О копление бактериальной массы, экстракцию клеточных липидов и идентификацию бактерий по фосфолипидному и жироокислотному составу клеточных липидов, отличающийся тем, 25 что, с целью повышения точности способа, дополнительно выявляют наличие половых гибридов Флекснера по составу фосфатидилэтаноламинов и дифосфатидилглицерина.

1601119

Т а б л и ц а 3

Коэффициенты жирных кислот

Бактерии

Фрсфолипид

Кз к

К( Сиз:o

С1ь:1 + ЧС 17; о

ЖК нечетн.

С „,, + ЧС, .,о

С . +ас„-, ЖК чети, ФЭ

ДФГ

Составитель С. Бандурин

Техред И.: одели. Корректор Л,Бескид

Редактор Н.Яцола

Заказ 3246 Тираж 492. Подписное

ВНИИПИ Государственного ;:омитета по изобретениям и откр;„ » ям .при ГКНТ СССР

113035,:,.1сква, Ж вЂ” 35, Раушская :a6., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "!1атент", г.ужгср. д, ул. Гагарина,101

Е.coli HfrH

Sh.f1exneri

Гибрид

Е.coli HfrH

Sh.flexneri

Гибрид

Таксономическая значимость

>2

>2

<2 - 1 2

<2 с2

Семейство

-=1

«1

>1

<1 1 1

Род, вид а2

)2 а2

«2

=1 2

Род, вид