Способ определения активности эпоксидгидролазы

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изучения активности и свойств фермента эпоксидгидролазы в различных органах и тканях. Целью изобретения является упрощение способа и увеличение его чувствительности и точности. Способ заключается в том, что после проведения ферментной реакции образовавшийся продукт-фенилэтиленгликоль (ФЭГ) экстрагируют из инкубационной смеси н-бутанолом, аликвоту бутанола без предварительного концентрирования подвергают анализу методом ВЭЖХ в системе гексан-изопропиловый спирт-вода (76-84):(26-30):(1,8-2,6) и проводят детектирование ФЭГ при длине волны 210 нм.

„„SU„, 15679 1

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН ($g) $0 01 И 30/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ! б i

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ fXHT СССР (2 I ) 4379651/30-13 (22) 17,02, 88 (46) 30.05.90. Бюл. В 20 (71) Институт питания АМН СССР (72) В.С.Соболев, Л.В.Кравченко и В.А.Тутельян (53) 577.15,08,088 ° 8) (56) Сотниченко А.И,, Сердюк О.А. и др, Хроматографический метод опреде- ения активности мембранной эпоксидгидролазы. — Антибиотики и медицинская биотехнология. Т. 30, 1985, 11 . 7, с. 535-538.

Schoket В., Vincze I. Act tahar..

m8col еС Toxico, 1986, ч. 58,, р, 156-158, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ЭПОКСИДГИДРОЛАЗЫ

Иэобр: тение относится к биотехнологии и мси=бт быть использовано для излучения активности и свойств .фермеi та эпоксиб идролазы в различных орга нах и тканях.

Цель изобретения — упрощение способа и увеличение его чувствительности.Способ заключается н том, что после проведения ферментной реакции образованшийся фенилэтиленгликоль (ФЭГ) экстрагируют из инкубационной смеси н-бутиловым спиртом,.аликвоту бутанола без предварительного концентрирования подвергают анализу методом ВЭЖХ в системе гексан-иэопропиловый спиртвода (80:28:2) и проводят детектирование ФЭГ при дуб > . наг.в..; О, и

2 (57) изобретение относится к биотехнологии и может быть испольэонано для изучения активности и свойств фермента эпоксидгидролаэы в различных органах, б и тканях. Целью изобретения является упрощение способа и увеличение его чувствительности и точности. Способ заключается н том, что после проведения ферментной реакции образовавшийся продукт-фенилэтиленгликоль (ФЭГ) экстрагируют из инкубационной смеси н-бутанолом, апиквоту бутанола без предварительного концентрирования ппнергают аиапизу методом ВЭЖХ в системе гексан-изопропилоный спирт-нода (76-84 ): (26-30): (1,8-2, 6) и проводят детектирование ФЭГ при длине волны

210 нм. 4 табл.

Способ осуществляется следующим О образом.

В инкубационную смесь, состоящую из 0,15 М трис-НС1 буфера (рН 8,7) и ферментного препарата (м кросомы), нносят стиреноксид, растворенный в ацетонитриле, После инкубации при

37 С пробы переносят в ледяную баню, добавляют н-бутиловый спирт и насыщенный расТВор (ИН4)zh0> Встряхивают и аликвоту бутилового спирта отбирают для хроматографического анализа, Для определения уровня неферментного гидролиэа стиреноксида параллельно опытным ставят контрольние пробы, отличающиеся от них только тем, что ферментний препарат предварительно подо вергают нагрсван б ври 100 С в тече1567971 ние 5 мин. Для анализа алкивот бутилового спирта на содержание ФЭГ используют жидкостный хроматограф, колонку с силикагелем П1trasphere — si, в

5 качестве подвижной фазы используют систему гексан — изопропиловый спиртвода (ЯО:28:2) при скорости потока

1,5 мп/мин. Обнаружение ФЭГ осуществляют с помощью УФ-детектора при дли- 10 не волны 210 нм, Количестненное определение ФЭГ проводят с помощью интегратора с использованием внешнего стандарта ФЭГ, Активность эпоксидгидролазы (А) рассчитывают по формуле

1о-1к

А=-- — — (нмоль/мин на 1 мг белка), t>m где P — количество ФЭГ, образовавшееся в опытных пробах, в результате ферментного гидролиза, нмоль;

P — количество ФЭГ, образовавшееся в контрольных пробах н результате неферментного гид<5 ролиза;

С вЂ” врЕмя инкубации, мин;

m — количество белка, внесенного в инкубационную смесь, мг.

П р и м e p 1, Определение aK Hs- y0 ности микросомальной эпоксидгидролазы печени крыс.

Для вьщеления фракции микросом печень После декапитации животных немедленно извлекают, тщательно промывают 0,154 М КС1, измельчают путем продавливания через перфорированную пластину и гомогенизируют в гомогениэаторе Поттера-Эльвейема (тефлон-стекло, 1200 об/мин, 90 с), используя в качес40 тве среды для гомогенизации 0,154 M

КС1, содержащий 50 мИ Трис-HC1 (pH

7,4) в отношении 1:3 (вес/объем). Все процедуры проводятся при 4 (;. Гомогенаты подвергают центрифугированию при 45

10000 g в течение 20 мин при 4 C. Надосадки переносят в центрифужные охлажденные пробирки и подвергают центри-. фугированию при 105000F н течение

60 мин. 1Iолученный осадок — фракцию

50 микросом ресуспендируют в среде, используемой для гомогенизации нз расчета: частицы иэ 1 r ткани н Я мл среды>

В опытные пробирки добавляют 0,34 мл

0,15 М трис-НС1 hyAepa (рН 8,7) и

0,05 мл сусиензии микросом, прогре- дают н течение 2 мин при 37 С на нод, о ной бане, после чего вносят 0,01 мл

50 мМ стиреноксида> растворенного в ацетонитриле. R контрольных пробирках суспензию микросом перед добавлением нагревают при 1ОО С н течение 5 мин, Опытные и контрольные пробирки инкубируют в течение 15 мин при 37 С, затем переносят н ледяную баню и добавляют по 1 мл н-бутилового спирта и 0,5 мл насыщенного раствора (NH ) БО > встряхивают в течение 10 с и отбирают по 5 мкл н-бутилового спирта для хроматографического анализа..Цля анализа использован жидкостной хроматограф "Altex" модель 332, колонка (25 см>

> 4,6 мм) и предколонка (4, S см >,6 мм) с силикагелем Wtrasphere-si (размер частиц 5 мкм) в качестве подвижной фазы используют систему гексан — изопропилоный спирт — вода (80: 28: 2) при скорости потока l S мп/мин. Обнаружение ФЭГ осуществляли с помощью

УФ-детектора Kratos-Б1 -757 при длине волны 210 нм (0,005 At(I"H> конст. времени 0,5 с). Время удерживания составляет для ФЭГ 4 мин. Количественное определение ФЭГ проводят с помощью интегратора "Hhimadzu С-НЭА" с использованием внешнего стандарта (коммер4 ческого поепапата ФЭГ), Лредел обнаружения ФЭГ согласно способу составляет 5 нмоль но вколе.

Расчет активности эпоксидгидролазы: количество ФЭГ, образовавшегося в результате ферментного гидролиза (Рб ), составляет 17,7 нмоль; количество ФЭГ> образовавшегося н результате неферментного гидролиза (p„) составляет 1,6 нмоль; время инкубации 15 мин.

Количество микрогомального белка, добавленного в пробу, составляет

0,12 мг

17,7-1,6

А=--- ---4--=8 94 нмоль/мин на

15>0> 12

> 1 мг белка

Результаты пяти параллельных определений представлены н табл. 1„

Среднее значение согласно табл. 1 активности эпок сид гидр ол азы сост анл яет 9 54 нмоль/мин на I мг белка, хоэффициент вари ации метода 3, 77, Пример 2, Определение степени извлечения ФЭГ.

В пять пробирок,, содержапщх

0,34 мл О, 15 М Трис-НС1 буфера (рН

8,7) и 0>05 мп суспензии микросом, добавляют 6 мкг (43 5 нмоль ФЭГ коммерческий грепарат ) в 0> 01 мп аце15679

Таким образом, степень иэвлечетыя

ФЭГ из инкубационной смеси составляет

92,2+0,8% °

Пример 3. Определение степени извлечения ФЭГ в отсутствии сульфата аммония и при его разных соотношениях.

В S пробирках, содержащих по

0,34 мп 0,15 М Трис-НС1 буфера (pH

8, 7 ) и О, 05 мл суспензии микросом, 15 добавляют 6 мкг (43,5 нмоль) ФЭГ (коммерческий препарат) в 0,01 мп ацетонитрила, Экстракцию и количественное определение ФЭГ проводят,, как в при-20 мере 1, добавляя v каждые 2 пробирки разный объем насыщенного водного раствора сульфата аммония (4 определения в двух повТорениях), Результаты определения представлены в табл. 3. сидгидролаэы, предусматривающий выделение микросомной фракции иэ клеток печени, проведение ферментной реакции со стиреноксидом, выделение продуктов реакции экстракцией органическим растворителем, их идентификацию и количественную оценку методом ВЭ .КХ, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с цел.-" упрощения способа и увеличение его чувствительности, выделение продуктов ферментативной реакции осуществляют экстракцией н-бутанолом в присутСтвии сульфата аммония, а при идентификации и количественной оценке методом ВЭЖХ апиквоты бутанольного экстракта используют силик агельную фазу и систеии растворителей гексан-иэопропанол вода при объемном соотношении растворителей 76-84:?6-30:1,8-2,2 с УФ-де-тектированием при длине волны 210 нм. т Таблица

Таким образом, максимальная степень извлечения (92,37) ФЭГ наблюдается при -использовании в процессе экстракции 0,5 мп насыщенного раствора 30 сульфата аммония, Близкие значения степеней извлечения наблюдаются и при использовании больших количеств раствора сульфата аммония, однако из экономических соображений в способе используют минимальный его объем (0,5 мл). . Пример 4, Определение активности микросомальной эпоксидгидролаэы печени крыс при различном соотноше- 40 нии к омпоне нто в подвижной фазы, Выделение микросом и определение, активности зпоксидгидролизы проводят, как в пример е 1, но при соотношениях компонентов, приведенных в табл. 4. 45

А, нмоль /мин на мг белка

Ркэ нмоль

P нмоль

8,,94

1,6

17,7

9,88

l,9

19ь7

9,67

1,6!

9,0

9,55

l,6

l8,8

9,67

1,6

19„0 тонитрила„ lKстракцию и количественное определение ФЭГ проводят, как в

1три мере 1, Результаты содержания ФЭГ сведе5 ны в табл, 2.

71 6

Приведенные подвижные фазы харак= териэуются приблизительно одинаковым временем удерживания ФЭГ,. Форма пиков ФЭà — правильная (распределение

Гаусса), за пределаьы укаэанных соотношений компонентов, время удерживания может значительно изменяться, пик

ФЭГ уширяется > приобретает "перегибы", ;три уменьшении доли воды в подвижной фазе происходит раздвоение пика ФЭГ, что объясняют возрастанием роли конкурентного адсорбционного механизма хроматографии (на активных центрах силикагеля) по сравнению с распределительным (в планке воды) .

Таким образом, оптимальным является соотношение компонентов подвижной фазы гексаниэопропанол - вода 76-84:

:26-30;1,8-2;6.

Фор мула из обретения

Способ определения активности эпок156797 ) Т а бл н ц а 2

Степень извлечения, Х

Пробир- ФЭГ, нмоль ка Ф

93,3

92,7

89,0

93,4

92,6

Таблица 3

Среднее значение стеПробир- Объем добавленка, У ного раствора сульфата а мония 9 Nn пе ни иэ вл ечения ФЭГ, X

78,7

1-2

3-4

92,3

0,5

89,9

О, 7

5-6

92,0

1 0

7-8

Т аблица4

Состав под- Соотношение викной фазы к. ;понентов

Время удержания, ж н

Гексан-изопропанол-вода 76:26:1,8

Составитель А. Семенов

Техред М.Ходанич Корректор П. Муска

Редактор М.Келемеш

Заказ 1320

Тирам 494

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж" 35, Раушская наб., д. 4/5 1

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óêãoðîä, ул. Гагарина,101

То ме

То ае

41 01

40,33

38,70

40,65

40,29

80; 28:2

84 30=,2 2

3,8-4,6

3,8-4,6

3, 8-4,6