Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами
Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения степени поражения пищевых продуктов метаболитами грибов. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа определения степени поражения зерна микроскопическими грибами. Для этого предлагается после размалывания зерна проводить определение степени поражения зерна путем приготовления водных экстрактов зерна и добавления их в реакционную смесь, содержащую НАДН ФМН-оксидоредуктазу, люциферазу и их субстраты и измерения интенсивности свечения, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивности биолюминесценции экстракта зерна к интенсивности биолюминесценции реакционной смеси. 6 табл. 1 ил.
СОНИ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (19) 00 (1) С 0! N 33/10
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
HAQH:ФИН-оксилорелуктаза +
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
fN ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГННТ СССР (21) 4272105/31-13 (22) 30.06.87 (46) 15.04.90. Бюл. !1- 14 (71) Институт биофизики СО АН СССР .и Всесоюзный научно-исследовательский институт зерна и продуктов ег!э переработки (72) В,А,Кратасюк, Н,Б,Плотникова, Л,С,Львова и Н,Ю. Орлова (53) 664.7(088.8) (56) Львова Л.С., Шатилова Т.И., Шальгина А,П, Прикладная биохимия и микробиология, И,, 1976, т ° 1 2 )) 3, с,442-448. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ IIOPA»
ЖЕНИЯ ЗЕРНА МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ (57) Изобретение относится к биохимии, Изобретение относится к исследованию материалов химическими способами и может быть использовано для определения степени загрязнения зерна метаболитами грибов, Целью изобретения является повышение точности определения и упрощение способа, На чертеже представлена зависиМость интенсивности свечения от времени реакции, 2 в частности к способам определения степени поражения пищевых продуктов метаболитами грибов ° Цель изобрете- . ния - повышение точности и упрощение способа определения степени поражения зерна микроскопическими грибами, Для этого предлагается после размалывания проводить определение степени поражения зерна путем приготовления водных экстрактов зерна и добавления их в реакционную смесь, содержащую
НАДН ФИН-оксидоредуктазу, люциферазу и их субстраты и измерения интенсивности свечения, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивности биолюминесценции экстракта зерна к интенсивности биолюминесценции реакционной смеси. 6 табл,, 1 ил.
Способ осуществляют следующим образом, Приготавливают водный экстракт зерна и добавляют его в реакционную смесь, содержащую НАДН:ФМН-оксидоре° дуктазу, люциферазу и их субстраты, наличие метоболитов в экстракте определяют по интенсивности свечения, Для анализа используют биферментную систему НАДИ:ФИН-оксидоредуктаза-люцифераэа, Эти ферменты катализируют цепь двух сопряженных реакций:
1557521 мой люцифераэой: люцифеоаза
ФИНН + RCOH + Π— — — — — + ФМН + RCOOH + Н О + свет и Z 1
Полученный в этой реакции ФИНН используется в реакции, катализируегде ФМН ФМНН - окисленная и восстаВ новленная формы флавинмононуклеотида;
НАД,НАДН вЂ” окисленная и восста- 10 новленная формы нико тинамиддинуклеотида;.
RC0H — длинноцепочечный алифатический альдегид, gCOOH — соответствующая жир- l5
l ная кислота, Особенностью этой системы является то, что одним из продуктов реакции является светоизлучение в сине-зеле-. ной области спектра (длина волн 520- 20
600 нм).
Экстракты зерна не флуоресцируют °
Зерно размалывают, проводят водную экстракцию, затем из экстракта удаляют остатки размолотого зерна, 25
Приготавливают реакционную смесь, содержащую НАДИ:ФМН-оксидоредуктазу, ° люциферазу.и субстраты ФМН, НАДН и
RC0H. Реакцию инициируют добавлением
НАДН и измеряют интенсивность био- 30 люминесценции на специальном приборе биолюминометре, который состоит из кюветной части, фотоэлектроумножителя, усилителя фототока и регистрирующего устройства (самописец, осциллог- 3 раф и т.п,), Как видно из зависимости, представленной на чертеже, в течение некоторого времени после начала реакции интенсивность свечения растет, дости- 40 гает своего максимального значения и затем начинает медленно падать, Через 20-30 с после достижения максимума биолюминесценции измеряют величину
I, и затем в реакционную смесь добав- 45 K ляют водный экстракт зерна, наблюдают при этом снижение интенсивности биолюминесценции, измеряют Т и по величине отношения Х /Ik судят о степени поражения зерна, чем меньше величина I /I тем сильнее поражено зерно, Пример 1 ° Водные экстракты зерна кукурузы приготавливают следующим образом: к 10 кг размолотого зерна добавляют 30 мл дН О, экстрагируют при постоянном встряхивании на качалке в течение 1 ч и центрифугируют 5 мин при 5 тыс,оборотов в 1 мин, Для измерения интенсивности свечения приготавливают реакционную смесь, содержащую 50 мкл раствора НАДН:ФМНоксидоредуктазы (О, 1 ед, активности в I мл), люциферазы (0,3 мг/мл} и
ФМН { 8 ° 1 0 M), 50 мкл О, 0025/-но го
t раствора тетрадеканаля, 200 мкл
0,1 M фосфатного буфера рН 6,8, 200 мкл 4 1 0 M раствора НАДН. Интенсивность свечения этой реакционной смеси измеряют на биолюминометре в условных единицах, В отсутствие водного экстракта (контроль) интенсивность свечения I 37 усл,ед.
При внесении в реакционную смесь
20 мкл водных экстрактов кукурузы, зараженной в разной степени метаболитами грибов, интенсивность свечения падает, измеряют I .
В табл,1 представлены примеры реализации способа для образцов зерна кукурузы, Точность метода определяли, измеряя среднеквадратичную ошибку в серии из 3-5 измерений для каждого об.разца, Из табл,! видно, что ошибка не превышает 107. Таким образом, точность .метода увеличена по сравнению с прототипом в 2,5-3 раза, время анализа сокращено до 1 ч, т,е, в 6-7 раз метод прост в исполнении, уменьшены трудовые затраты по сравнению с прототипом, Пример 2, В табл,2 представлены примеры реализации способа при добавлении в реакционную смесь разных количеств водных экстрактов кукурузы образца 11 - 3 (количество грибов444,5 тыс/г, содержание ЗФС
1040 мг/кг) .
Как видно из приведенных данных, реализация предлагаемого способа не зависит от количества добавляемого экстракта зерна, Таким образом, предлагаемый способ позволяет при использовании разных количеств экстракта зерна повысить точность определения и уменьшить временные и трудовые затраты, Пример; .3, Водные экстракты нормальной и плесневелой пшеницы приготавливают следующим образом: к 3 г размолотого зерна добавляют 9 мл
1557521 6
Как видно из табл,5, с увеличением к оличес тва фу за риозных з ерен воз- растает степень ингибирования биолюминес ценции °
Таким образом, сравнение примеров 1,2 . и пр..жеров 3,4,5, осуществленных при разном выборе соотношения компонентов, входящих в реакционную смесь, показывает, что от выбора сол) отношения компонентов, входящих в
). реакционную смесь, не влияет на результаты определения, Так как измерения степени поражения зерна всегда
15 проводят по величине относительного изменения интенсивности свечения
/I », то абсолютные величины I о е, и Т» не имеют значения при реализации способа, 20 Пример 6, В табл,6 представлены примеры реализации способа для и- разных количеств водного экстракта е- нормальной и фузариозной (ЗОЖ фузаРиозных зерен)пшеницы, Условия изме25 рения аналогичны примеру 3.
Как видно из данных табл,б предлагаемый способ реализуется при разных количествах экстракта зерна пшеницы, добавляемого в реакционную смесь, 30 Однако в зависимости от сорта„ вида зерна может меняться величина I /Т», Количество экстракта подбирается экспериментально, Таким образом, предлагаемый способ а позволяет увеличить точность измерения в 3-4 раза (ошибка измерений не превышает )OX) уменьшить трудовые а- затраты, Предлагаемый способ является экспресс-методом (время одного.иэ40 мерения 1-1,2 ч), прост, доступен, мое- жет -быть использован для рутинных изд- мерений, дН О, экстрагируют при постоянном встряхивании на качалке в течение
10,30,60 мин при 30 С, Далее экстрак ты центрифугируют при 5 тыс,оборотов в 1 мин в течение 5 мин, либо фильтруют через бумажный фильтр, Для измерения биолюминесценции пр готавливают реакционную смесь, содер жащую 50 мкл раствора НАДН:ФМН-оксид редуктазы (0,01 ед, активности в 1 м люцифераэы (0,015 мг/мл), ФМН (1,7 ° 10 М), 50 мкл 0,0025Х-ного рас вора тетрадеканаля, 500 мкл О,1 M фосфатного буфера рН 7,0, 200 мкл
-Ф
НАДН (4 ° 10 М) . Интенсивность свечения этой реакционной смеси измеряют в условнйх единицах на биолюминометр
10 мкл экстрактов зерна добавляют в реакционную смесь после достижения постоянной интенсивности биолюмннесценции (I ) и измеряют I после дост жения нового уровня интенсивности св чения в присутствии экстракта, В табл.З представлены примеры реа лизации способа в зависимости от вре иени экстракции.
Иэ табл,3 видно, что результаты реализации способа практически не за висят от времени экстракции, от прие ма отделения остатков зерна: центрифугированием или фильтрацией.
Данные по определению количества белка в экстрактах, приведенные в табл,3, свидетельствуют о том, что н результаты определения не влияют . время приготовления экстракта и спо соб отделения обломков зерна (содерж ние белка в экстрактах практически одинаково).
Пример 4, В табл.4 представл ны примеры реализации способа для во ных экстрактов зерна кукурузы, зараженного в разной степени микроскопическими грибами. Приемы измерения све- 45 чения аналогичны приведенным в примере 3, В реакционную смесь добавляют
20 мкл водного экстракта кукурузы.
Из табл,4 видно, что имеется связь между количеством грибов, содержанием ЗФС и величиной Х /I (с увеличением степени поражения зерна величи-. на I>/Х» уменьшается).
Пример 5. В табл,5 представлены примеры Реализации способа для пшеницы. Условия измерения аналогичны примеру 3. В реакционную смесь до" бавляют 5 и 10 мкл водного экстракта пшеницы, Формула изобретения
Способ определения степени пораже-,. ния зерна микроскопическими грибами, заключающийся в размалывании зерна, приготовлении экстракта, введении его реакционную смесь и определении в экстракте наличия грибных метаболитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и упрощения способа, в ка- . честве реакционной смеси используют смесь, содержащую НАДН:ФМН-оксидоредуктазу, люциферазу и их субстра..ты, наличие метаболитов в экстракте определяют по интенсивности их свече155752) присутствии экстрактов зерна и без него, ния, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивностей биолюминесценции реакционной смеси в
Таблица 1
Количество грибов разных видов, .Ф тыс/г
Концент- Т, Т /„Т рация усл,ед, ЗФС, мг/кг
Общее коли0 0 0,3 0
10,5 0 26,0 364
0 70,0 95,0 1040
Таблица 2
КОличест . Т (в ТО в ТО/ ê«%
ВО ВОДНО» УСЛ à ЕД в УСЛ а ЕД а
ГО экст рак та, мкл
5 42
10 42
20 40
50 40
71+3,3
45+5,3
35+3,7
14+3,8
19
13,5
5,5
Та блица 3
Время экстракции, мин
Т /| в%
Пшеница плес нев ела я
Пшеница нормальная
5 мкл 10
5 мкл 10 мкл 20 мкл Белок мг/мл мкл 20 мкл Белок мг/мл!
О (центр.)
30 (центр,)
60 (центр,)
30 (фильтр,) 027 96 78
18 0,28 89 64
0 32 91 66
21 0 25 87 72
Та блица 4
):î,/Тк «% (20 мкл экстракта) Количество грибов, тыс/г
3,7
117,0
435, 0
1970,8 чество грибов, тыс/г
Контроль
0,92
63,6
444,5
0
50,0
0,2
25,0
220,0
77 36 .87 33
74 42
88 51
Содержание ЗФС, мг/кг
6 2-69
104 0
520, 0
416,0
48
33
37
29
100+2, 7
78,4+5,6
54,1 -4,8
35,1+3,7
0,24
40 0,31
27 0,27
29 0,27
1557521
Таблица 6
Таблица 5 о/ к, Пшеница узариэная
Колич е«
Количество фузариоэйых зерен пшеницей у Х ство эк стракта, мкл еница
10 мкл мкл
P льная
0,43
0i53
Oi87
1,27. !
ОО,О
62.8
44,4
5,5
?6
18
gppwp в гу
Составитель М,Шапкина
ТехредЛ.Сердшкова Корректор Н,Король
Редактор Л,Веселовская
Заказ 716 Тирам 509 Подписное!
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
9,0
10,0
15 0
91,9
77,7
69,7
46,5
43,3
19,2
20,0
18,2
5,9
61,4
46,7
28,6
20,?
11,1
13i3
10,2
10,9
6,0
2,7
3,2
30,5
31
41,1
29,3
35,4
30,0
19
12,4
14,0
15,5
2э?
2,4
