Способ идентификации генотипов многолетних злаков трибы пшеницевые (тriтiсеае)

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к проблеме маркирования белками генетических систем растений и использования белковых маркеров в решении актуальных вопросов прикладной ботаники, генетики, селекции. Целью изобретения является увеличение точности анализа мелких семян многолетних кормовых злаков. Способ состоит в том, что проламины извлекаются из семян в результате замачивания зерновок в дистиллированной воде, отделения препаровальными иглами зародыша, выдавливания полужидкого эндосперма с последующей экстракцией в 5-10 мкл экстрагирующего раствора, а электрофорез осуществляется в вертикальных пластинах полиакриламидного геля толщиной 1 мм, и экстракт наносится в стартовый карман слоем 0,5-0,8 мм. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„) 546022 А 1 (51) 5 А 01 Н 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 растений и использования белковых маркеров в решении актуальных вопросов прикладной ботаники, генетики, селекции. Целью изобретения является увеличение точности анализа мелких семян многолетних кормовых злаков ° Способ состоит в том, что проламины извлекаются из семян в результате замачивания зерновок в дистиллированной воде, отделения препаровальными иглами зародыша, выда вли ва ния полужидкого эндосперма с последующей экстракцией в

5-10 мкл экстрагирующего раствора, а электрофорез осуществляется в вертикальных пластинах полиакриламидного геля толщиной 1 мм, и экстракт наносится в стартовый карман слоем

0,5-0,8 мм. 1 табл ° (21) 4346164/31-13 (22) 02.11.87 (46) 28.02.90. Бюл, N 8 (71) Центральный сибирский ботанический сад СО АН СССР (72) А. В. Агафонов и О. B. Агафонова (53) 575.633. 112. 1 (088 ° 8) (56) Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции.

И., Наука, 1985. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ

МНОГОЛЕТНИХ ЗЛАКОВ ТРИЬЫ ПЫЕНИЦЕВЫЕ (TRITICEAE) (57) Изобретение относится к биотехнологии, в чаcòíîñòè к проблеме мар. кирования белками генетических систем

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к проблеме марки" рования белками генетических систем растений и использования белковых маркеров в решен и актуальных вопросоВ прикладной ботаники, генетики, селе кции .

Цель изобретения - увеличение точности а на лиза мелких семя н.

Способ осущест вляется следующим

Образом.

Очищенные от цвето>ных чешуй зер" новки раэмачи вают в дистиллирова нной воде в течение суток. Препаровальной иглой удаля ют за р одыш и вьда вли ва ют полужидкую массу эндосперма с помощью тонкого стержня, прокатывая им с вершины эерновки до ее основания, .Полученный изолированный эндосперм с массой 0,2-1 мг, отделенный от оболочки и зародыша, содержит все запасные белки без примесей, образующихся при размоле зерновки и составляющих

20-60 ее массы. Отсутствие примесей дает возможность проводить экстракцию белков в более жестких условиях в течение 12-18 ч при 40 С в 5-10 мкл

70> этанола или 504 изопропанола в герметичных микропробирках. Указанная последовательность операций позволяет провести наиболее полную экстра кцию пролаии новой фра кции запасных белков. После центрифугирования получают 3-5 мкл концентрированного экстракта, который смешивают в соотношении 2:1 с электродным буфером электрофоретичес кой системы, содержащим 60 сахароэы, и вторично цент1546022 рифугируют. Приготовленный экстракт подвергают электрофоретическому разделению в вертикальной пластине

1-миллиметрового полиа криламидного геля, при этом высокая концентрация проламиновых белков в экстракте позволяет наносить в стартовый карман тонкий слой экстракта 0,5-0,8 мм.

Этим достигается значительное повышение разрешающей способности электрофоретического метода, Ширина стартового кармана существенной роли не играет и может варьировать в пределах 3-6 мм. Термостатирование гелевой пластины в процессе электрофореза при 8-12 С позволяет повысит ь напряженность электрического поля до

35-37 В/см и сократить время разделения белков в пластине длиной 12 см до 2,5 ч. Способ позволяет проводить индивидуальный анализ мелких зерновок многолетних кормовых злаков с массой менее 5 мг для идентификации

cQpToB и Видов р экОтипОв и фОрм ° Кро 25 ме того, появляется возможность анализироват ь электрофоретические спектры проламинов у гербарных образцов, собранных десятки лет назад, что становится необходимым при уста новлении филогенетических взаимоотношений °

Ра змачи ва ние зер нов ки в дистиллированной воде, удаление препаровал ьной иглой зародыша и выдавливание с помощью тонкого стержня полужидкой массы эндосперма обеспечивает анализ индивидуальных зерновок маленьких размеров. Полученный таким способом и золирова нный э ндосперм, с одержащи и все запасные белки без примессй, при- 40 годен для экстра кции и дальнейших процедур, связанных с разделением белков в модифицированной электрофоретической системе.

Способ иллюстрируется следующими 45 примера ми .

Пример 1. Имеются семена кормового шла ка пырейника новоанглийского (пырея бескорневищного) сорта

"Первомайский" и образцы семян из

50 природных популяций двух таксономических видов рода пырейник (п.шероховатостебельный и п.новоанглийский), различающихся незначительным морфологическим признаком (степень опушенности колоскового членика). Предва55 рит ел ь ный морф ологи ч ес ки и а на л и з с ортовых семян показывает, что среди них часть следовало бы отнести к одному виду, а часть - к другому, а также выделить ряд промежуточных форм с неясной видовой принадлежностью.

В опыте ставится задача сравнить проламиновые спектры двух таксономических видов, каждый из материала сорта "первомайский" и из двух отдаленных мест дикого произрастания с тем, чтобы оценить правомерность разделения указанных видов на основе незначит ел ьных морфологичес ких отличий.

Выборки зерновок из каждого указанного в таблице образца после отделения цветочных чешуй помещались в водяные камеры на 24 ч.

Кроме того, для объективного сопоста вления зле ктрсфоретических спектров, полученных s серии опытов, в качестве стандартного маркера анализируются по 2 зерновки пырейника сибирского с известным компонентным составом спектра.

С размоченных зерновок удаляют избыток воды фильтровальной бумагой, препаровальной иглой отсекают зародыш и через от верстие в оболоч ке выда вли ва ют полужидки и э ндосперм, прокатывая с противоположного конца зер" новки тонким стержнем из нержавеющей стали. Этим же стержнем изолированный э ндос и ер м, с оста вля ющи и у пырея бескорневищного 0,3-0,6 мг, помещают в полиэтиленовую микропробирку с

8 мкл 503 и зопропа нола, гомогени зируют, закрывают герметичной пробкой и помещают в термостат с температурой

40 С на 12-15 ч. По истечении времени микропробирки охлаждают до комнатной температуры, взмучивают осадок тупой иглой и центрифугируют 5 мин при 12000 р, Супернатант по возможности полност ью отсасывают микропи- и ет кой и с меши ва ют в с оот ношении 2: 1 с алюминий-лактатным буфером РН 3,1, содержащим 60 сахарозы и краситель пиронин, после чего образцы вторично центрифугируют 15 мин при 12000 g °

Для электрофоретического разделения проламинов применяют однородную гелево-буферную систему с вертикальными пластинами 1-миллиметрового

9 -ного полиа криламидного геля на алюминий-лактатном буфере РН 3,1. Одновременно анализируются 24 пробы, которые наносят под слой электродного буфера в количестве 2 мкл. Электрофорез проводят при напряжении фор мула и з обр ет ения

Способ идентификации генотипов многолетних злаков трибы пшеницевые (Triticeae) включающий приготовление экстракта проламинов, электрофоретическое разделение проламинов в верти кал ь ных пластинах полиа криламидногогеля, отлича ющи йс я тем, что с целью увеличения точности анализа мелких семян, экстракт

40 проламинов готовят из изолированного эндосперма, полученного путем размачивания семян в дистиллированной воде с последующим удалением зародыша, выдавливанием полужидкой массы эндосперма и экстракцией s 5-10 мкл экстрагирующего раствора, а электрофорез проламинов проводят на пластинах геля

t толщинои 1 мм с нанесением в стартовый карман экстра кта слоем О, 5-0,8 мм.

5 15460

440 e e течение 2 5 ч, охлаждая гелевую пластину накладными оргстеклянными х ол одил ь ни ка ми с ци р кули р ующей водой при 10-12 С. Гели фиксируют в 12 -ной трихлоруксусной кислоте

5 (ТХУ) и окра ши ва ют О, 1 -ным красителем Кумасси - 250 мл. в 123 ТХУ в течение 18-20 ч, не снимая со второго стекла. Окрашенные гели дифферено

10 цируют 7 -ной уксусной кислотой и фотографируют в проходящем с вете.

В спектрах изученных образцов пырейника присутствует от 13 до 19 компонентов ра зной и нтенси вности. При

15 этом около половины компонентов с определенной частотой встречается во всех изученных природных и сортовых образцах.

Ряд компонентов распределен случай- 20 ным образом, независимо от морфологии колоскового членика, некоторые компоненты спектра характерны только для определенного природного экотипа.

На ос нова нии ра нее уста новленных 25 закономерностей распределения проламиновых компонентов у дикорастущих злаков пшеничной трибы можно считать

У что предста вит ели разных биологических видов не могут иметь в составе проламиновых спектров идентичные совокупности компонентов. Таким образом, все изученные образцы пырейника следует отнести к одному виду - п.шерохова т ост ебел ь ный . . Пример 2. Имеется партия семян многолетнего кормового злака пшеницевой трибы с утерянными сортовыми с видетел ьст ва ми. В с оста в пшеницевой трибы входит 9 родов многолетных зла ков, включая важные в кормовом отношении, такие как пырей, пырейник, житня к, Kojloc HR K ломкоколосник и т.д. Сходное строение зерновки позволя ет применят ь описа нную методику идентифика ции компонентов пролами на, (преобладающего запасного белка зерновки), основа нную на предлагаемом способе, как единую для всех

22 6 предста вит елей трибы. Для точного определения сортовой принадлежности необходимо провести электрофоретическое разделение белкового экстрак" та эндосперма серии семян неизвестного образца и полученные спектры сравнить с аналогичными спектрами известных сортов.

Таким образом, предлагаемый способ дает возможност ь провести паспортизацию существующих сортов кормовых злаков трибы пшеницевые а так) же контролировать все этапы селекционного процесса, апробации и районир ва ния при создании новых хозяйственно ценных форм, значительно снизив экономические затраты на многие процедуры, позволяет достоверно анализировать природные экотипы дикорастущих пшеничных злаков, предста в.ляющих большой интерес для интродукции, а также идентифицировать герба р ные обра з цы, с одержа щи е семена (независимо от сроков хранения), в целях уточнения внутри- и межвидовых филогенетических связей в трибе.

1546022

Мест о сбора, г од

Та, кс о номи и ес ки и вид

Природные поп уля ции

П. шероховатосте" бел ьный

Влади вост ок, 1986

То же

П. Но воа нгли йс ки й

Влади вост ок, 1986

Новоси бирс к, 1986

П. шероховатосте" бел ьный

»н»

П.Новоанглийский

Новосибирск, 1986

П. шероховатосте" бельный

То же

П-новоанглийский

То же

Пр омежут оч на я форма

«11»

Составитель В. Демкин

Реда ктор М. Недолуженко Техред Л. Сердокова Корректор С. Черни, Заказ 33 Тираж 432 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., л. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101

Получен из

Омского

СИБНИИСХОЗа, 1987

Количест во Примечание зерновок

От обра ны из семя н пырея из бескорневищного сорта

"Пер вома йс ки й"