Способ получения сорбента для аффинной хроматографии

 

Изобретение относится к химической технологии, конкретно к получению сорбента для аффинной хроматографии антибиотиков ванкомициновой группы, и может быть использовано в биохимии и микробиологии. Изобретение позволяет повысить емкость сорбента до 12, 17 мг/мл за счет того, что сорбент получают активацией аминоэтилцеллюлозы глутаровым альдегидом и последующей обработкой трипептидом β-аланил-глицил-D-аланина в буферном растворе при PH 7,8 и боргидридом натрия.

союз ссветсних

СОциАлистичес,! их

РЕСПУБЛИН

А1

6ЫЫЛ".! 1 - :) ПАЛ Чтя I :;. .:-.:i,"::.. „ä

Е - Б. ;:1 .) ..:.;4

ГОСУДАРСТНЕННЫЙ КОМИТЕТ пс изОБРетениям и ОтнРытиям

ПРИ ГННт СССР

1 (21 ) 43133) 7/31-05 (22) 02.10.87 (46) 07,02.90. Бюл. № 5 (71) МГУ им. М,В. Ломоносова (72) r,С. Катруха, Ж.П. Трифонова и И.Г. Смирнова (53) 661.728,8 (088.8) (56) Corti А., Cassani G, Synthesis

and characterization of D-Alanyl-DAlanine-Айагose. — Аррl. Biochem.

Вхо1есй., 1985, у. 11, р. 101-109.

Европейский патент ¹ 0122969, кл. С 07 К 1 /00, опублик, 1984.

Изобретение относится к области химической технологии, а именно к получению сорбента для хроматографии группы антибиотиков-ванкомицинов, и может быть использовано в биохимии и микробиологии, Целью изобретения является повышение емкости сорбента °

Пример. Получение трипептида р-аланил-глицил-D-аланина, К раствору 21,5 ммолй, производного аминокислоты НС1 D - Ala-ОСНз и

43 ммоль триэтиламина в 25 мл диметилформамида (ДМФА) добавляют 16,1 ммоль производного аминокислоты tBoc-Gly-ОРср (t я„= 79-80 С), смесь перемешивают 1,5 ч при 20 С, растворитель упаривают в вакууме, остаток суспендируют в воде и полученный дипептид Вос-01у-D-Ala-ОСН экстрагируют этилацетатом, промывают водой, вы—

„„SU„„1540856 (51)5 В 0) J 20/30, С 08 В 15/00

-2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА

ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (57) Изобретение относится к химической технологии, конкретно к получению сорбента для аффинной хроматографии антибиотиков ванкомициновой груп пы и может быть использовано в биохимии и микробиологии. Изобретение позволяет повысить емкость сорбента до 12,17 мг/мл за счет того, что сорбент получают активацией аминоэтилцеллюлозы глутаровым альдегидом и последующей обработкой трипептидом р-аланил-глицил-D-аланина s буферном растворе при рН 7,8 и боргидридом натрия, сушивают над сульфатом натрия, упаривают в вакууме, а остаток выдержива-ют 20 мин в 10 мл 6 н, НС1 в диоксане. Растворитель удаляют в вакууме, Q3 остаток растворяют в 20 мл абсолют- ф ного ДМФА и к раствору HCl Н Cly-DAla-ОСН добавляют 40 ммоль триэтиламина и 10 ммоль Вос-p-Ala-OPtp. Ql

Смесь перемешивают 1 ч при 20 С, раст- @ воритель удаляют в вакууме, остаток суспендируют в 0,1н, НС1 .и трипептид

Вос-р-А1а-Gly-D-Ala-OCH экстрагируют этилацетатом, который выдерживают над Na>80< и упаривают в вакууме. Ос- а таток после упаривания обрабатывают смесью СНЗОН вЂ” 1н. NaOH (2:15 по объему) в течение 45 мин, раствор подкисляют 1н. НС1 до рН 2-,0 и Вос-pAla-Gly-D-Ala-0H экстрагируют этилацетатом, который затем удаляют в вакууме, К остатку добавляют 4 мл бн.

1540856

HCl в диоксане, через 10 мин растворитель удапяют в вакууме, остаток выдерживают в вакуум-эксикаторе, перекристаллизовывают из водного спирта и по"

5 лучают 2,0 г трипептида НС1-р-AlaGly- Ý-Ala-ОН, (d 1 р =. +22 (Н О, C=l ), аминокислотный анализ (после гидролиза 6н. Сl, 107 С). получают : p-Ala

Gly (I), D-Ala (I) электрофоре- 1О тически однородное вещество с подвижностью по Е -Рп -T „зц д1, = 1,35 в системе НСООН-СН -СООН-Н О (28:20:52 по объему), Анализ проводят. на автоматическом аминокислотном анализаторе.15

Получение сорбента.

2,r аминоэтилцеллюлозы .(АЭЦ) промывают на фильтре 0,1 М раствором щелочи и затем водой до нейтрального значения рН, суспендируют в 0,1 И

Na-фосфатном буфере с рН 7,6, добавляют глутаровый альдегид в 2-кратном избытке по отношению к свободным аминогруппам АЭЦ (0,1 Мэкв/r), смесь встряхивают в течение 20 ч, активированную АЭЦ фильтруют, промывают водой, суспендируют в 0,1 М Na-фосфатном буфере с рН 7,8, к смеси до бавляют избыток 0,1 r трипептида Н-/ь"

"Ala-Gly-D-Ala-ОН, после встряхивания при 20 С фильтруют, осадок промывают водой, суспендируют в 0,1 М

Na-боратном буфере при рН 9,1, добавляют 0,1 г Na ВН, через несколько часов фильтруют. Сорбент промывают до нейтрального рН и высушивают в вакуум-эксикаторе, 100 r сухого сорбента суспендируют в 3 мл 6 M соляной кислоты и термостатируют в вакуумированной ампуле 40

20 ч при 107 С. После упаривания гидролизата в вакууме проводят количественный аминокислотный анализ на автоматическом анализаторе аминокислот ° В 100 мг сорбента содержится по 6,16 мкмоль глицина и аланина и, таким образом, полученный сорбент содержит 61,6 мкмоль лиганда в 1 г сухого образца.

Высокая избирательность сорбции ,и десорбции на полученном сорбенте ,подтверждена на примере следующих антибиотиков ванкомициновой группы

Ф и их производных: ристомицин А, актиноиднны А и В, ванкомицин, актапланин, А 41030, А 47934, А 35512В, агликон ристомицина А, агликон ванкомицина, агликоны актиноидина А и В, ристозаминил-агликон ристомицина А и др.

Определение экспериментальной ем-. кости сорбента в отношении антибиотика ристомицина А, Через колонку диаметром 1 см, содержащую 1,0 г сорбента, пропускают циркуляционно со скоростью 0,46 мп/мин

10 мл раствора ристомицина А сульфата (20 мг/мл) в О, 02 М а-фосфатном буфе-, ре, содержащем 0,5 М, NaC1, до постоянной оптической плотности выходящего раствора, измеренной при il-= 280.нм, Сорбент промывают водой от избытка несорбированного антибиотика и затем 0,25 М аммиаком, рН 11,2 до полной элюции антибиотика. Элюат упаривают в вакууме, остаток растворяют в 0,01 М HCl и определяют оптическую плотность раствора при

= 280 нм. По формуле Dykey = где Е= 10330, определяют количество сорбированного антибиотика, равное

28 мг. Таким образом, экспериментальная емкость сорбента равна 28 мг/г (13,59 мкмоль/г) или 12,17 мг/мп (5,91 мкмоль/мл сорбента). Антибиотик ристомицин А после выделения с колонки полностью сохраняет свои антимикробные и физико-химические свойства.:

Константа связывания для ристомицина.А равна К = 9,10>10 лМ (по известному способу К = 4,68 10 лИ 3, Формула из обретения

Способ получения сорбента для аффинной хроматографии антибиотиков ванкомициновой группы активацией аминоэтилцеплюлозы глутаровым альдегидом с последующей обработкой лигандом в буферном растворе и боргидри-. дом натрия, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости сорбента, в качестве лиганда используют трипептид л-аланил-глицил-D--алании и обработку лигандом проводят при рН 7,8,