Способ получения пептидов

 

Изобретение касается получения пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, определяющую биологически активный пептид или протеин. Цель изобретения - создание универсального способа. Последний включает расщепление пептида формулы H-X-PRO =пептид, где X-MET, LEU, SER, ASP, PHE

пептид - последовательность аминокислот телячьего панкреатического полипептида, фактора секреции гормона роста, A(SO<SB POS="POST">3</SB><SP POS="POST">-</SP>)<SB POS="POST">4</SB>-инсулин-А-цепь сульфонат, B(SO<SB POS="POST">3</SB><SP POS="POST">-</SP>)<SB POS="POST">4</SB>-инсулин-В-цепь сульфонат или проинсулин. Процесс расщепления ведут в слабокислой среде при 25-50°С и концентрации кислоты, например уксусной, 0,25-0,5 моль в апротонном растворителе - N-метилпирролидоне, диметилсульфоксиде, N,N-диметилформамиде, с образованием и расщеплением в момент образования дикетопиперазинового производного с получением пептида и дикетопиперазинового H-X-PRO -остатка. Эти условия позволяют расщеплять белок или пептид, имеющий остаток пролина, и осуществлению этого процесса не мешает присутствие в пептидной цепи метионина, лизина. 2 з.п.ф-лы, 12 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

E .(21) 4028458/23-04 (22) 27. 10. 86 (31) 791837 (32) 28.10.85 (33) US (46) 23 ° 12.89. Бюл. 11 47 (71) Зли Лилли энд Компани (US) (72) Ричард Деннис Димарчи и Джеральд Стефен Брук (US) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Шредер Э., Любке К. Пептиды.

И.: Мир, 1967. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается получения пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, определяющую биологически активный пептид или протеин.

Цель изобретения — создание универсального способа. Последний включает расщепление пептида формулы Н-Х-PrOпептид, me Х-Met 1.eu, Ser, Asp, Изобретение относится к усовершенствованному способу получения пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, определяющую биологически активный пептид или протеин, который может найти применение в биохимии и биотехнологии.

Цель изобретения — создание универсального способа получения пептидов.

Обработку соединения Н-Х-Pro-пептид проводят в среде апротонного

Ф растворителя. Примерами апротонных растворителей могут служить: N-метил„„80„„1531858 A 3 (51) 4 С 07 К 7/00 // А 61 К 37/02

Phe, пептид — последовательность аминокислот телячьего панкреатического полипептида, фактора секреции гормона роста, A(SO>)< инсулин-A-цепь сульфонат, В(SO ) -инсулин-В-цепь сульфонат или проинсулин. Процесс расщепления ведут в слабокислой среде при 25-50 С и концентрации кислоты, например уксу :ной, 0,25-0,5 моль в апротонном растворителе — И-метилпирролидоне, диметилсульфоксиде, N,N-диметилформамиде, с образованием и расщеплением в момент образования дикетопипераяинового производного с получением пептида и дикетопиперазинового Ц-X-Гго-остатка. Эти условия позволяют расщеплять белок или пептид, имеющий остаток пролина, и осуществлению этого процесса не мешает присутствие в пептидной цепи метионина, лизина. 2 з.п. ф-лы, 12 табл.

I пирролидон(ИМП), N.N-диметилформамид (ДЕФА), диметилсульфоксид (ДАССО), причем наиболее предпочтительным является 11МП.

Реакцию в апротонном растворителе проводят в слабокислых условиях с использованием уксусной кислоты.

Процесс проводят в температурном интервале 25-50 С.

Выбор температуры реакции зависит от стабильности пептида и природы третьей кислоты в системе Н-X-Ргопептид, Предпочтительной является максимально высокая температура, со1531858

55 ческие растворите.-ги ответствующая стабильности и природе третьего аминокислотного остатка.

Реакцию расщепления периодически контролируют, следя за ходом образования дикетопиперазина. При необхо5 димости реакцию прерывают и получаемый в результате расщепления продукт выделяют из реакционной смеси с использованием известных методов.

Выбранние пептиды, используемые в качестве моделей для предлагаемого способа, получают методами твердофазного синтеза, Их чистоту подтверждают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения. Перед расщеплением такие пептиды хранят в виде аморфных лиофплизированных твердых веществ. Число экспериментапьггых параметров изменяют (показано их вли20 яние на реакцию расщепления) .

Ниже приведены оптимизированные условия с использованием органической и водной сред соответственно и их применение на пептиде Met-Pro-Г1у-01У-NTI<, где И11 обозначает присутствие ацидного фрагмента на С-окончании пептида.

Условия органического расщепления.

10 мг Met-Pro-Gly-Gly-NTI< растворяют в 1 мл ИМП, который обезвоживают хранением в течение недели над о молекулярньгми ситами размером 4А. о

Смесь выдерживают при 25 С при постоянном перемешивании и реакцию инициируют добавлением 0,33 M ледяной уксусной кислоты (НОАС). За ходом расщепления следят по образованию метионин-пролин-дикетопиперазина и исчезновению исходного пептида, анализируя эти величины методом обратимофазной хроматографии. Хроматографическое определение проводят с использованием колонки размером 0,46х х25 см с Ultrospere Сг в 0,1/-ной трифтоэуксусной кислоте (ТФК), приме45 няя в качестве элюента ацетонитрильный градиент. Во время каждого анализа реакцию останавливают путем десятикратного разбавления 0,1Х-ным раствором ТФК. Дикетопиперазиновый пик собирают и его идентичность подтверждают аминокислотным и масс-спектральньм анализом.

В табл. 1 представлены данные по уровню образования дикетопиперазина при раз пгчных концентрациях кислоты в условиях расщепления, проводимого при 25" С в среде jI11ФА. Регистрируют заметггчю скорое гь реакггии и устанавливают, что она зависит от концентрации слабой кислоты. При проведении аналогичной обработки в среде

ДИСО установлено уменьшение скорости расщепления.

Как показано в табл. 2, увеличение температуры расщепления до 40 С в среде Д11СО приводит к повышению скорости реакции до значений, сравнимых с теми, что достигаются в среде

ДИФА при 25 С.

Из табл. 1 следует, что оптимальная концентрация кислоты лежит в интервале 0,25 — 0,5 моль.

В табл. 3 представлены результаты исследования влияния температуры на серии пептидов, в которых изменяют только боковую цепь третьего остатка.

Повьппенное стерическое затруднение на этом участке замедляет скорость реакции. Однако во всех случаях отмечается заметное расщепление.

Важным фактором является выбор апротонного растворителя. В качестве растворителя до гжно бить выбрано вещество, которое промотирует, или по крайней мере не ингибирует образование дикетопипераэина, что сопровождается расщеплением с образованием желаемого конечного продукта, и в то же время оказывает минимальное деградирующее действие на пептидный продукт, В табл. 4 приведены данные по стабильности ряда протеинов и пептидов в условиях их органического расщепления, которую определяют методом обратимофазной жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPT,С), показано остающееся после воздействия на выбранный протеин или пептид количество определенной реакционной среди в течение указанного времени и относительное преимущество Д11СО по сравнению с !Р1ФА.

В табл. 5, аналогично табл. 4, представлены результаты по стабильности с использованием метионильного человеческого гормона роста.

В табл. 6 представлены результаты исследования влияния ряда растворителей на расщепление г ген.-Pro-Gly-Gly-N11 .

Как следует из представленньгх данных, предпочтительными растворителями являются ИИП, jLIOA и, LICO, представляющие ссбо I апротонние органи15318

В табл. 7 приведены результаты исследования влияния температуры на ряд пептидов при использовании в качестве растворителя ДИФА или ДМСО.

Из табл. 1-7 следует, что ДМФА по сравнению с ДАССО оказывает большее влияние на образование дикетопиперазина и сопровождающее его расщепление, однако, это соединение оказывает более сильное деградирующее действие на протеиновый или пептидный продукт.

Для достижения оптимальных результатов следует установить хороший баланс 15 в выборе реакционных условий в отношении конкретного пептидного или протеинового продукта.

В табл. 8 представлены данные, полученные в результате применения условий органического расщепления на модельном пептиде, имитирующем предлагаемое соединение, в котором группа пептида представляет собой человеческий гормон роста. В последнем две первые аминокислоты представляют собой Phe — Pro. Таким образом, возникает возможность образования дикетопиперазина из фрагмента Х-Pro предлагаемого соединения и нахождения следующей формы дикетопипераэина из инициирующего фрагмента Phe — Pro, полученного в результате применения человеческого гормона роста.

В табл. 8 приводится сравнение

Met — Pro - Phe — Thr — Ile — МН2 с

Phe — Pro — Thr — I le — МН . Лслучен2 ные результаты свидетельствуют о медленном образовании дикетопипераэина из последнего вещества.

Таким образом, условия обработки предлагаемого соединения Ме — Pro человеческий гормон роста могут быть точно установлены с тем, чтобы мак симизировать первичное образование дикетопиперазина и сопровождающее его расщепление при минимальном вторичном образовании дикетопипераэина.

В этом отношении NMII представляет собой наиболее желательный растворитель, поскольку в его присутствии уровень образования дикетопипераэина значительно выше, чем в случае ДМСО, и близок к значениям, достигаемым в

ДМФА на поздних стадиях реакции. Учитывая повышенную стабильность гормона роста в ММЛ по сравнению с ДМФА (табл. 5), можно сделать вывод, что первое иэ указанных веществ является

58 6 желательным растворителем по крайней мере для данного применения.

Оптимальное водное расщепление

Met — Pro — G1y — Gly — МН достигается в результате растворения 1 мг пептида в 1М натрий-фосфатном буфере при рН 8,0. С целью ускорения расщепления температуру в течение 24 ч подо ,держивают равной 55 С. Степень расщепления определяют по предлагаемому способу для органического расщепления.

Условия водного расщепления. Оптимальное водное расщепление Met - ProGly — Gly — NH2 достигается в результате растворения 1 мг пептида в

1М натрий-фосфатном буфере при рН

8,0 ° С целью ускорения расщепления температуру в течение 24 ч поддержио вают равной 55 С. Степень расщепления определяют по предлагаемому способу для органического расщепления.

В табл. 9 приведены значения выхода расщепления при рН 7,0 с использованием в качестве субстрата пептида Met — Pro — Gly — Gly — МН

Реакцию проводят при трех различных температурах с использованием различных концентраций двух буферных солей. Лолученные результаты показывают, что фосфатный буфер является предпочтительным по сравнению с ацетатным, причем наилучшие результаты обеспечивает концентрация 1,0М.

В табл. 10 представлены результаты исследования влияния рН на образование метионин-пролин-дикетопиперазина из Met — Pro — Gly — Gly — МП при 40 С в буферной водной среде.

В качестве буферной соли применяют фосфат натрия. Полученные результаты свидетельствуют о предпочтительности щелочных значений рН. Поскольку такие нежелательные побочные реакции, как деамидирование и десульфурирование, ускоряются при повышенных значениях рН, предпочтительным является рН 8.

В табл ° 11 приведены резу: ьтаты изучения влияния различных буфернык солей на степень расщепления Met

Pro — G1y — Gly — NII при рН 8,0 и

40 С. Предпочтительным буфером является фосфат натрия.

В табл. 12 представлены результаты исследования влияния температуры на образование метионин-пролин-дикетопиперазина из ряда пептидов, в ко

1531858

Таблица 1

Образование метионин-пролин-дикетопиперазина из Met — Pro — Gly — NH при 25 С

Реагент

Г (4 6

10 M НОАС/ДЕФА

1 М НОАС/)1МФА

О, 1М HOAc/ДИсЬА

0 Ä 01М НОАС/ДМФА

100Х ДМФ

100Х ТФК

34

4

44

28

3

26

13

О

О торых изменяют только боковую цепь третьего остатка от N-окончания ° Как и в случае исследования, результаты которого представлены в табл. 3, ясно, что усиление стерических затруднений на участке третьего остатка замедляет реакцию. Однако во всех случаях кроме двух, наблюдается заметное расщепление. Повышение температуры от 40 до 55 С заметно увеличио вает скорость и степень расщепления всех четырех испытанных тетрапептидов .

Анали з продуктов, полученных в результате расщепления образцов пептидов и протеинов, проводят мегодами анионообменной и обратимофазной хроматографии высокого разрешения.

Анионообменную хроматографию проводят на Мопо С1 колонке с 0,05 M трис-буфера, рН 8,0, содержащего ЗОБ ацетонитрила. Элюирование проводят с применением линейного градиента хлористого натрия. Анализ методом обратимофазной хроматографии осуществляют на колонке с Zorbax С, размер пор о

150 Л с использованием ацетонитрильного градиента в 0,1 М фосфате аммоо ния при 45 С и рН 7,0.

Предлагаемый способ позволяет расщеплять белок или пептид, имеющий остаток пролина, при этом его осуществлению не мешает присутствие в пептидной цепи метионина и лизина.

Фо р мул а и з о б р е те ни я

Способ получения пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, определяющую биологически активный

5 пептид или протеин путем расщепления природных пептидов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью создания универсального способа, соединения общей формулы:

Н-Х-Pro-пептид, где Х вЂ” Met, Leu, Ser, Asp, Phe; пептид — последовательность аминокислот телячьего панкреатического полипептида, фактора секреции гормона роста, A(SAq)4-инсулин-А-цепь сульфонат, В(БО ) -инсулин- В-цепь суль20 фонат или проинсулин, подвергают расщеплению в слабокислых условиях при 25-50 С и концентрации кислоты 0,25 — 0,5 моль в апротонном растворителе с образованием и

25 расщеплением в момент образования дикетопиперазинового производного с получением пептида и дикетопиперазинового Н-Х-Pro-остатка.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю30 шийся тем, что в качестве апротонного растворителя используют

М-метилпирролидон, диметилсульфоксид, N.N-диметилформамид.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве кислоты используют 0,33 М уксусную кислоту.

Содержание компонента, 1, за время реакции, ч

1531858

Т а б л и ц а 2

Образование метионин-пролин-дикетопиперазина из Met — Pro — Gly — NH z при 40 С

Содержание компонента, Х, за время реакции, ч

Реагент

4 24

0,1 М НОАС/Л1СО

0,33 M НОАС/ДМСО

1,0 M НОАС/ДМСО

3,3 M НОАС/ДМСО

10,0 M HOAc/ДМСО

Таблица 3

Образование метионин-пролин-дикетопиперазина в

1М уксусной кислоте (ДМФА) о

Содержание компонента, 7, при температуре, С

Пептид

25

Время реакции, ч

2 24

MPGG-ИН

MPTG 4 411г

27

Не определяют

То же

Не определяют

То же

76

МРРГ-МН

МРГС-ИНа

1О

MPGG-NH <-Ме t

MPTG-ИН -Met

MPPG-%1 -Met

MPFG-%1 - 1et

Pro — Gly — G 1 y

Pro — Thr — Gly

Pro — Pro - Gly

Pro — Phe — Gly

Таблица 4

Содержание компонента, I за время реакции, ч

Протеин"

1М НОАС/ДМСО, 40 С

Т 24

1М НОАС/Д ФАА, 40 С

2 в

2 24 48

Глюкагон ррах Ф

GPF з)+

42

79

100

141Н

"Нг г

"Нг

49

26

38

27

37

32

О

61

44

12

124

52

98

100

94

41

117

89

100

119

86

86

12

1 531858

Продолжение табл.4

Протеин

Содержание компонента, Х, за время реакции, ч

1М НОАС/Я1ФА, 40 С

1М НОАС/ДМСО, 40 С

24 4

2 1 8

2 24 48

a(so )

Проинсулин (Leu - Pro -) 62

37

106

43

30

97

86 к

Телячий панкреатический полипептид PP (Met — Pro -) .

GPF — Фактор секреции гормона роста (Met — Pro — ).

А(80 )4 -инсулин А-цепь S-сульАонат

1.eu — Pro —.

8(S0 ) -инсулин-В-цепь S-сульФонат

3 2

Относительный процент остатка, определенный по отношению к необработанному внешнему контролю.

Т а блица 5 о

Содержание компонента, Х, при 40 С за время реакции, ч

Ре агент (24

78к /78ек

91/100

85/90

45/34

75/86

77/75

65/68

77/99

70/89

0,33 M HOAc/ËMÔA

0,33 М НОАС/Д1СО

0,33 И НОАС/NMP

Определяют методом обратимофазной HPLC.

*к

Определяют методом анионообме иной HPLC. ! Таблица 6

Зависимость расходования Met — Pro — Gly — Gly — NH< от образования Met — Pro — дикетопиперазина о

Содержание компонента, X. при 25 С за время реакции, ч

Реагент

0 2 4 6 24

66

99

114

100

1М НОАС/СН > CN

1М НОАС/н-РгОН

97

11

99

96

71

101

104

88

1М НОАС/MeOFI

1М НОАС/СН Cl

1М НОАС/Я!ФА

1И НОАС/Щ1СО

Не определяют

100 к

Количество оставшегося исходного вещества.

+% о

Определяют при 40 С.

99

99

57

Не определяют

1531858

Таблица 7

Образование метионин-пролин-дикетопиперазина в двух выбранных растворителях в присутствии

1М НОАС при 40 С.

Пептид

Содержание компонента, 7, за время реакции, ч

ДИСО

124

76

22

88

36

5

100 100

11 38

43 65

12 23

- Gly — The

Pro

- Phe

С1у ™ я.

Gly - NHz

Gly - ИН, PIo

Pro

Pro

Pro

Та блица 8

Содержание компонента, 7, при 40 С за время реакции, ч

Реа гент

INet — Pro - Phe — Pro — Thr — Ile

0,33 И НОАС/ИМР 17

0,33 М НОАС/ДАССО 4

0,33 М НОАС/ДМФА 14

Phe — Pro — Th r — I le

0,33 М НОАС/NNP 7

0,33 М НОАС/ДАССО 4

0,33 М НОАС/ЛИ< А 15

47

27

99

33

23

11

78

27

Таблица 9

Влияние различных буферных систем и их концентраций на образование метионин-пролин-дикетопипераэина иэ

Net — Pro — Glv — Gly — 11Н2 при РН 7,0 о

Выход расщепления, Х, при температуре, С

Буфер

25

100

93

12

14

4

О,1 М фосфата натрия

1,0 М фосфата натрия

0,1 И ацетата натрия

1,0 М ацетата натрия

+ Образование метионин-пролин-дикетопиперазина при 100 С измеряют через о

2 ч, образование этого продукта при 40 и 25 С - через 72 ч.

MPGG NH2

NPTG-N1I

МРРС-11Н, NPFG-NH

2 с

iPGG

MPTG

NPFCMPFG—

%1 -Met

ИН -Met

NH -Met

NH -Met

2 пН2

32

47

NH

12

26

1531858

Таблица 10

Влияние значения рН на образование метионин-пролиндикетопипвраэина в 1,0 M фосфата натрия при 40 С

Выход метионин-пролин-дикетопиперазина, Х, за время, ч рН

24 48

1

18

27

1

Таблица 11

Влияние различных буферных солей на обра зов ание пр олин-дике то пипе ра зина из Met — Pro — Gly — Gly — Инг при рН 8,0 и 40 С

Выход пролин-дикетопипераэина, 7., эа время, ч

Буфер

1,0 М фосфата натрия

1,0 М фосфата натрия

1,0 М сульфита натрия

35 !

Таблица 12

Образование метионин-пролин-дикетопиперазина при разных температурах в 1,0 И фосфатном буфере при рН 8,0

Пептид+

Выход метионин-пролин-дикетопипера зина, 7, при температуре, С

40

Время реакции, ч

1 48 I (2 24 48

2 24

16

0

С1 1Н г

Gly NH г

Gly—

Th I

Pro—

Phe

MPGG=NHz

MPTG-NH, MPPG NH1

MPFG-%1г

МРСС вЂ” NH< -Ме t

MPTG — NH< -Me t

МРРС вЂ” NH< -Me t

-Met

Pro

Pro

Pro

Pro

84

18

12

22

29

96

26

19

47

6

31

18

89

97

86

47

9

92

100

53