Способ определения активности антитромбина ш в плазме крови

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изучения патологии системы гемостаза. Цель - повышение точности способа. Проводят сопоставление графической записи на тромбоэластографе процесса образования сгустка фибрина в контрольной смеси тромбина с фибриногеном и в опытной пробе такой же смеси с добавлением исследуемой плазмы. Расчет полученной записи тромбоэластограмм проводят по двум параметрам - хронометрическому и структурному.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (д 4 G 01 N 33/48

ЫЫ.. ;:5iUN. 1) ) (.f1 1 1 . I.,ь Я „3ц ) В Е ЛИСг; .; —,д,!

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЖЗБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4200533/28-14 (22) 07, 01 87 (46) 15. ».89. Бюл. М 42 (71) Московский медицинский стоматологический институт им. Н.А. Семашко (72) В. Н. Алекса ндров, Г. Н. Будя кова, И. Г. Бобринская, Т. И. Таранова и Л. ф. Кармолина (53) 612. 015 (088.8) (56) Методы исследования фибринолитической системы крови/Под ред. Г.В.Андреенко, М.: МГУ, 1981, с. 96.

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулологии, и может быть использовано клинико-диагностическими и научно-исследовательскими лабораториями при диагностике нару" шений гемостаза.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается путем регистрации образования сгустка фибрина в стандартной смеси тромбина с фибриногеном (контрольная проба), а также в такой же смеси с добавлением исследуемой пла змы (опытная проба ) с помощью тромбоэластографа одновременно в двух пробах на параллельных каналах. При сопоставлении графической записи контрольной и опытной проб рассчитывается активность антитромбина III по хронометри чес ким и структурным параметрам графической записи.

„„SU„„1522102

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

АНТИТРОМБИНА III В ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изучения патологии системы гемостаза.

Цель - повышение точности способа.

Проводят сопоставление графической, записи на тромбоэластографе процесса образования сгустка фибрина в контрольной смеси тромбина с фибриногеном и в опытной пробе такой же смеси с добавлением исследуемой плазмы.

Расчет полученной записи тромбоэластограмм проводят по двум параметрам— хронометрическому и структурному.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемую кровь отбирают из вены > и смешивают со стабилизатором в обыч- р ном соотношении. Затем из нее путем центрифугирования осаждают тромбоциты. Обедненную тромбоцитами плазму дефибринируют. Дефибринирование про" и з водят нагрева ни ем в водя ной ба не до 56 С. М

Растворы для стандартной смеси: коммерческий раствор тромбина с активностью 15-16 с(т.е. в количестве

О, 2 мл, способный за 15-16 с с вернуть 0,3 мл 0,44-ного раствора коммерческого фибриногена); раст вор фибриногена 0,43 в буфере Михаэлиса, рН 7,8.

Раствор тромбина инкубируют при

О

37 С и добавляют к нему исследуемую плазму. Затем смесь переносят в раствор фибриногена, находящийся в кювете тромбоэластографа (температура кюветы также 37 С), Одновременно в другую кювету прибора, содержащую такое же количество фибриногена вносят раствор тромбина - контрольная проба. Включают запись тромбоэластограммы, Активность антитромбина III рассчитывают по процентному соотно" шению временных и структурных параметров тромбоэластограммы в контрольной и исследуемой пробах по формулам:

А = -- 100%, где t „- время образоваto

K 5 ния сгустка в опытной пробе, t „- время образования сгустка в контрольной пробе; A - активность антитромбина

III характеризующая скорость инактивации тромбина.

MAO

А = --- 1003 где MA - максим MA " о мальная амплитуда тромбоэластограммы

B опытной пробе, ИА„- максимальная амплитуда тромбоэластограммы в контрольной пробе; А „„д - активность антитромбина III, характеризующая степень инактивации тромбина.

П р и M е р 1. Используемые реа ктивы . 3,83-ный раствор цитрата натрия. Буфер Михаэлиса рН 7,8. Приго" тавливают из смеси двух растворов.

A. 20,6 г диэтилбарбитурата натрия растворяют в дистиллированной воде, доводят объем раствора до 1 литра.

Б. 0, 1 M р-р НС1, Смешивают 331 мл раствора А и 149 мл раствора Б. До" бавляют 7,07 r NaC1 ° Доводят объем буферного раствора до 1 л дистиллированной водой.

Раствор тромбина в буфере Михаэ40 лиса (О, 2 мл раст вора должны сверты" вать 0,3 мл О,й-ного раствора Фибри" ногена за 15-16 с) .

Раствор фибриногена. в буфере Иихаэлиса 0,4 ь.

Приготовление исследуемо" дефибринираванной плазмы.

Из вены здорового донора силиконированной иглой берут кровь (первые

0,5 мл сливают) и смешивают ее в пластмассовой пробирке с 3,81-ным раствором цитрата натрия в соотно" шении 9: 1. Центрифугируют при

1500 об/мин 5 мин. Отсасывают Богатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют при 4000 об/мин 20 мин, Отсасывают бедную тромбоцитами плаз-, му и прогревают ее на водяной бане при 56 С (этот параметр должен стоого соблюдат ься) 5 мин. Центрифугиру ют 10 мин при 4000 об/мин. Надосадочный слой плазмь! QTcBcblBGIQT °

Таким образом, плазму получают у

10 здоровых доноров, смешивают.в равных объемах в одной пробирке и берут смесь для проведения исследования на точность воспроизводимости метода.

В цельной смеси плазм активность антитромбина III по способу-прототипу условно принимают за 1004.

Ход определения. В пластмассовую пробирку набирают 0,8 мл раствора тромбина, прогревают в водяной бане при 37ОС 2 мин и добавляют к нему

0,2 мл исследуемой плазмы. Инкубируют при 37 С 3 мин (опытная проба).

В две кюветы тромбоэластографа на параллельные каналы вносят по 0,3 мл р-ра фибриногена (при 37 С в кюветах) и прогревают 1 мин. После этого в одну кювету вносят прогретую смесь тромбина и исследуемой плазмы " опытная проба. в другую кювету - 0,8 мл раствора тромбина (в течение 2 мин прогретого при 37 С) - контрольная проба. Сразу включают запись тромбоэластограммы, Полученные тромбоэластограммы опьтной и контрольной проб измеряют по следующим параметрам: параметр (мм)время от начала записи до расхождения краев тромбоэластограммы на 1 ммначало образования сгустка Фибрина; параметр MA - максимальная амплитуда — расстояние между краями тромбоэластограммы (мм). В этот момент сгу" сток обладает максимальной плотностью.

Расчет показателей тромбоэластограмм.

В первом случае в опытной пробе

t=1 ; мм, в контрольной пробе,=3 мм.

Активность анти тромбина III, хара ктеризующая скорость и на кти ва ции тромбина, определяется так:

А = - 100% = -- 100% = 350%. е 14

"с

Во втором случае в опытной пробе

ИА, = 5 мм, в контрольно" МА„=15 мм.

Активность антитромбина III, характеризующая степень инактивации тромбина, определяется:

AìÀ= ЙА 1003 = - 1- - 1003 = 333 к

Для выяснения степени точности предлагаемого метода определения ак1522

5 тивности антитромбина III в этой смеси плазму повторяли в 10 пробах (табл. 1) .

Анализ активности антитромбина III по способу-прототипу также проводился в 10 пробах этой смеси (табл,2) .

Величина квадратичного от клонения (6) ряда определений по способу-прототипу значительно больше и равна

+9,32. По заявленному способу определения с=+1,35 и +0,67. Ошибка метода -- 1004 по способу-прототипу такМ же з на чител ьно в we и ра вна 5Ф; по заявляемому способу " 2,83 и 43.

П .р и м е р 2. Используемые реактивы.

3,84-ный раствор цитрата натрия.

Буфер Михаэлиса рН 7,8 (Приготав" 20 ливают из смеси двух растворов: А.

20,6 r диэтилбарбитурата натрия растворяют в дистиллированной воде, доводят объем раствора до 1 литра, Б.

0,1 М р-р ÍÑI. Смешивают 331 мл рас" 25 твора А и 149 мл раствора Б. Добавляют 7,07 r NaCI. Доводят объем буферного раствора до 1 л дистиллирован" ной водой). раствор тромбина в буфере Михаэли" 30 са (0,2 мл раствора должны свертывать 0,3 мл 0,44 раствора фибриногена за 15-16. сек). раствор фибриногена в буфере

Михаэлиса 0,44.

Приготовление исследуемой дефиб"

35 ринированной плазмы.

Из вены здорового донора силиконированнои иглой берут кровь (первый 0,5 мл сливают) и смешивают ее в 40 пластмассовой пробирке с 3,8> раство. ром цитрата натрия в соотношении 9:1.

Центрифугируют при 1500 об/мин 5мин.

Отсасывают богатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют при

4000 об/мин 20 мин. Отсасывают бед.ную тромбоцитами плазму и nporpesaют ее на водяной бане при 56 С (этот параметр должен строго соблюдаться) в течение 5 мин. Центрифугируют .10 мин при 4000 об/мин,надосадочный слой плазмы отсасывают.

Затем плазму, полученную от 10 здоровых доноров, смешивают в равных объемах в одной пробирке. Полученную смесь разводят физиологическим раствором в соотношении 1, 1. Активность антитромбина-III по способу-прототипу в этой смеси принимается за 503.

102 6

Ход определения. В пластмассовую пробирку набирают 0,8 мл раствора тромбина, прогревают в водяной бане при 37 С 2 мин и добавляют к нему

0,2 мл исследуемой плазмы. Инкубируют при 37 C 3 мин (опытная проба).

В две кюветы тромбоэластографа на параллельные каналы вносят по

0,3 мл р-ра фибриногена (при т-ре

37 С в кюветах) и прогревают 1 мин, После этого в одну кювету вносят прогретую смесь тромбина и исследуемой

ruiaзмы - опытная проба, вдругую кювету — 0,8 мл раствора тромбина (npo" гретого в течение 2 мин при 37 С) контрольная проба. Сразу включают записb тромбоэластографа.

Полученные тромбоэластограммы опытной и контрольной проб измеряют по следующим параметрам: 1) параметр (в мм) - время от начала записи до расхождения краев тромбоэластограммы на 1 мм — начало образования сгустка фибрина; 2) пара метр МА - макси" мальная амплитуда - расстояние между краями тромбоэластограммы (в мм).

В этот момент сгусток обладает мак" симальной плотностью.

Расчет показателей тромбоэластограмм, В опытной пробе t z = 10 мм.

В контрольной пробе t = 4 мм.

А = - - 100ь = 2504 (активность

1О антитромбина-III, характеризующая скорость инактивации тромбина), I

В опытной пробе MAo = 8 мм. В контрольной пробе МА „= 15 мм.

A = -" 1004 = 603 (а ктивност ь

8 мв 15 антитромбина - III, характеризующая степень инактивации тромбина) .

Для выяснения достоверности ряда было проведено определение активности антитромбина-III в 10 пробах разведения смеси плазм доноров по заявленному способу и способу-прототипу (табл. 1 и 2).

Среднее квадратичное отклонение ряда заявляемого способа значительно меньше, чем способа-прототипа (0,68 и 0,65 против +5,44).

Ошибка метода та кже значит ел ьно меньше при использовании заявленного способа,(2,3Ф и 2,473 против 4,9Ф при ис пол ь зова ни и способа -прототипа ) .

1522102

Формула и зобрет ения

Способ определения активности антитромбина Ш в плазме крови путем инкубации тромбина с дефибринированной, бедной тромбоцитами, стабилизи" рованной плазмой, добавления полученной смеси к фибриногену с последующей инкубацией и определением времени образования сгустка, о т л и .ч а" 1О ю шийся тем, что, с целью повы1абли ца 1

Определение активности антитромбина"III по предлагаемому способу

Контрол ь

Разведения плазмы

11 1003 и/и

503 с ИА (мм) (мм) ИА (мм) (мм) ИА (мм) (мм) ИА (мм) (мм) NA (мм) (мм) 12

12

12

16

16

13

13

12

13

12

+0,21

Сред- 14 няя +0,41

M+M

f0 21 +0,2

5 14

+0,22 Й0,21

+О, 23

+0,22

10,2

10, 21

1003 1003

803

Е1,42

663

+1,48

1253 93 т4,95 «1,41

1753

+5,2

333 2503 1,30 + 5,76

2,473 2,9Ж

+0,65 «0,67

2,33

Н,35 0,67 «0,68

+0,68 0,65 +0,67 0,66

+0,68

<0,001<0,001 0,001 (0,001 0,001 (0,001 0,01 0,01

1 14

2 12

16

4 14

5 13

6. 15

8 13

14 t0 14 ь от 35А кон- +9,60 тро" ля

Овбка определения

„— ° 1003 2,83

5 10

4 9

6 10

5 9

11

6 9

5 l0

11

8

9

9 шения точности способа, инкубацию проводят в кюветах тромбоэластографа, при этом одновременно инкубируют пробу, содержащую фибриноген с тромбином, в обеих пробах определяют время образования сгустка, его плотность ипо разнице указанных показателей в первой и второй пробах рассчитывают активность антитромбина III в процентах, 14 4

5 14 -.3

4 14 4

4 15 5

4 15 5

5 14 5

5 14 4

5 13 4

6 13 4

6 14 4

1,783 4,1Ф 1,523 5,253 1,33

1О

1522102

Табли ца 2

Определение активности антитромбина-III no способу-прототипу

50ь 254 12, 53

100 ь

Вр емя обра зова ния с г уст ка, с

16

30. 29

32

31

32

28

33

29

22

Средняя

Мйм 5922 95

35+1, 72 27+1, 70 23+1,92

Ошибка определения

И

1003

8,3ь

4 сф

-5 44

6,3ь

+5,41 9 32 (0,2

Р (0,001 (0,001 (0,001

Составитель А. Потемкин

Редактор Н. Горват Техред Л.Олийнык Корректор М Самборская

Заказ 6953/41 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

И3035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина,101

3

5

7

9

64

68

68

66

42

32

32

31

48

33

31

34