Способ получения пригодных для оплодотворения половых продуктов у половозрелых рыб в любое время года

 

Изобретение относится к рыбоводству и направлено на улучшение качества получаемых половых продуктов и на возможность их получения у рыб различных видов. Для этого рыбам в качестве соединения с гормональным действием вводят нонапептид-C<SB POS="POST">1</SB>-C<SB POS="POST">4</SB> - алкиламиды или декапептидамиды общей формулы GLP-HIS-TRP-SER-TYR-X<SB POS="POST">1</SB>-X<SB POS="POST">2</SB>-X<SB POS="POST">3</SB>-PRO-X<SB POS="POST">4</SB>, где X<SB POS="POST">1</SB> - D-PHE, D-TRP, D-ALA, D-LEU, D-SER

X<SB POS="POST">2</SB> - TRP, PHE, LEU

X<SB POS="POST">3</SB> - GLN или LEU

X<SB POS="POST">4</SB> - GLYNH<SB POS="POST">2</SB> или C<SB POS="POST">1</SB>-C<SB POS="POST">4</SB>-алкил NH<SB POS="POST">2</SB>, или их соли. Соединение вводят периодически дозами, количество которых составляет 2-15. Величину доз устанавливают в соотсветствии с данными, приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или превышает ее в 1,5 раза. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (И) (5)) 4 А 01 К 61/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3827994/28-13 (22) 21.12.84 (31) 4457/83 (32) 23.12.83 (33) HU (46) 30.10.89. Бюл. )(- 40 (71) Кезпонти Валто-Еш Хительбанк РТ, Инновациош Алаи (HU) (72) Тамаш Гулиаш, Анико Хорват, Дьердь Кери, Карой Николич, Балаж

Секе и Иштван Теплан (Н()) (53) 639.3.034 (088.8) (56) Сельское хозяйство эа рубежом, 1978, N - 1, с. 43-44.

Aquaculture, 1983, )) 35, 1985, с. 173-176.

Изобретение относится к рыбоводству, а именно к способу получения половых продуктов у половозрелых рыб в любое время года, независимо от естественного периода нереста.

Половая активность рыб обоих полов регулируется выделяющимися из аденогипофиэа гонадотропинами, которые способствуют морфологическому н функцис нальному развитию половых желез (гонад), их гаметогенетической (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИГОДНЫХ ДЛЯ

ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ПОЛОВЫХ ПРОДУКТОВ У

ПОЛОВОЗРЕЛЫХ РЫБ В ЛЮБОЕ ВРЕМЯ ГОДА (57) Изобретение относится к рыбоводству, направлено на улучшение качества получаемых половых продуктов и на возможность их получения у рыб различных видов. Для этого рыбам в качестве соединения с гормональным действием вводят нонапептид — С,-С -алкиламиды или декапептидамиды общей формулы Glp-His-TrpSer-Tyr-Х,-Х -Х>-Pro-X+, где Х <

-D-Phe, D-Тгр, D-ala, D-leu, D-Ser;

Хг — Trp, Phe, Leu; X> — С1п или

Leu; Х вЂ” (1у NHz или С,-С -алкил

NHz, или их соли. Соединение вводят периодически дозами, количество которых составляет 2 — 15. Величину доз устанавливают в соответствии с данными, приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или превышает ее в 1,5 раза. 2 габл. (яйце- и спермопродуцирующей) деятельности и секреции половых гормонов.

Аденогипофиэ обоих полов у рыб выделяет два одинаковых гонадотропина: один носит обозначение FSH (стимулирующий фолликул гормон), другой — ЬН (лютеинизирующий гормон).

Гонадотропины не специфичны для полов, так как один и тот же РБН способствует гаметогенетической ак1519 3? 7. тивности как у самцов, так и у самок; один и ТоТ же LH возбуждаеT у особей мужского попа секрецию андрогена, а у особей женского пола эстрона или прогестерона, как FSH, так и LН являются гликопротеинами, которые обладают видовой специфичностью для рыб. ункцню эндокринной системы у рыб координирует гипофиэ. Кроме того, он координирует деятельность эндокринной и нервной систем, в первую очередь череэ вегетативное клеточное ядро, образующее нижнюю часть гипоталамуса.

Гипофиэ с помощью видовых специфических тропогормонов регулирует также процесс размножения. В естественных условиях овуляция у рыб происходит в специфический для данного конкретного вида среде, причем овупяционно зрелая икра рыб выметывается не самопроизвольно, а находится в состоянии вынужденного покоя вплоть до более или менее продолжительного установления пригодных для овуляции условий окружающей среды.

Эта характерная для рыб адаптация к условиям размножения регулируется гипофизом и центральной нервной системой совместно. К таком состоянии покоя н кровь рыб выделяется мало гонадотропина.

Для возникновения и формирования среды, подходящей для икрометания, требуется какой-то отрезок времени (например, поздняя осень или начало лета). Это означает, что репродуктивный (воспроизводящий) механизм регулирования у рыб делает возможной адаптацию процесса размножения к внешней окружающей среде. Это регулирование представляет собой результат координирующей сыгранности функций гипоталамуса и гипофиза.

Выбрасывание некоторых тропогормонов аденогипофиза регулируется нейрогормонами, которые освобождаются на идущих к отдельным ядрам клеток гипоталамуса нервных окончаниях, тотчас резорбируются в так называемых портальных капиллярах и попадают с кровью в синус аденогипофиэа.

Все известные нейрогормоны являют1 ся олигопептидами или полипептидами.

Нейро гормоны, стимулирующие секрецию тропогормонов, обозначаются как вьн-вобождающий фактор (КГ); нейрогормоны, подавляющие секрецию гормонов, — как ингибирующий фактор (ТГ).

5 (ля всех нейрогормонон отличи— тельным является то, что их дейстBus .hypophysektomierten животных соответствуют действию, появляющемуся после введения соответствующего тропогормона.

Базофильные плоскости гипофиза рыб обладают различиями обусловлен7 ными сезоном: их количество в период икрометания уменьшается.

В процессе адаг|тации к окружаю,щей среде образуются высвобождаю гщие гормоны (КН), которые с током крови попадают в гипофиэ и там регулируют. выброс тропогopMQHoa B p+ab

Таким образом, рыбы получают сведения о существовании окружающей среды, пригодной для икрометания, благодаря чему в гипоталамусе регулирующий лютеинизирующий гормон гормон LH/RH — активизирует гипофиз и выброс гонадотропина в кровь, в результате чего возбуждается процесс овуляции.

Когда рыбами воспринимается внешняя окружающая среда, обеспечивающая большие возможности для выживания потомства, то возникают импульсы, которые через органы чувств передаются эндокринной системе желез, и этот механизм активизирует находящуюся в вынужденном состоянии покоя репродуцирующую (воспроизводящую) систему.

Нейрогормоны черезвычайно интерспе40 цифичны: 1,Н/RH рыб имеет не такую последовательность, как LH/RH млекопитающих, и оказывает йа них такое же малое влияние, как и LH/RH млекопитающих на рыб.

Использование метода гипофиэирования (введение гипофиза рыбам путем инъекции) дает возможность индуцировать искусственное размножение рыб.

50 Для гормонального возбуждения овупяции используют отбираемые у половозрелых или почти половозрелых карпов гипофизы и консервируют последние. Нативные гормоны другого происхождения не принесли однозначного положительного результата.

Гипофиз карпов применяют при размножении многочисленных видов рыб.

5 15

Исключение составляют чуждые карпоI ,вым по систематике рыбы, например осетровые, для стимуляции которых используют гипофизы этих же видов рыб. Гипофизы берут у половозрелых рыб, обеэвоживают их с помощью ацетона и высушивают при комнатной температуре в течение 24 ч, затем раэмельчают в ступке и растворяют в физиологическом растворе °

Полученный раствор инъецируют в мышечную ткань рыб, а у маленьких рыб и у рыб с более рыхлым мясом инъекцию проводят в брюшную полость.

Способ гипофизарных инъекций дает хорошие результаты не во всех случаях, Основная причина этого заключается в том, что не всегда известно, в каком состоянии зрелости находятся рыбы, у которых отбирают гипофиэы, поэтому неизвестно и количество содержащихся в них гонадотропинов. Гормоны гипофиза карпов действуют только на карпов и на генетически близких к ним по виду рыб, поэтому многочисленные экономически важные виды рыб вообще не могут размножаться с помощью инъекций гипофиэа или размножаются с незначительной эффективностью.

С помощью гипофиэов при условии размножения в большом масштабе достигнуто в настоящее время только

LH-действие, FSH-действие нереализуемо по причине, указанной выше (неизвестно, в каком состоянии половозрелости находятся рыбы, у которых берут гипофизы).

Недостаток FSH äåéñòâèÿ позволяет применять гипофизирование только для индукции рыб с овуляционно зрелой икрой.

Кроме того, возможность индуцированного искусственного размножения при использовании гипофиза ограничена отрезком времени, составляющим естественный период нереста, что ведет к ограниченному использованию производственной мощности.

Получение гипофизов у рыб связано с уничтожением потенциально очень ценных и имеющихся в ограниченном количестве производителей, что также является недостатком известного способа.

Известно использование для получения половых продуктов рыб других соединений, обладающих гормональным

1952? 6 действием и являющихся синтетическими аналогами 1.H/RH-гормонов. Однако получаемые при их использовании ик5 ринки окружены фолликулярной оболочкой, которая препятствует их оплодотворению и получению нового потомства. Область применения этого способа ограничена карповыми рыбами и и лососем.

Пелью изобретения является улучшение качества полученных половых продуктов и возможность их получения у рыб различных видов.

Поставленная цель достигается путем введения в организм половозрелой рыбы новых производных гонадолиберина, так как известно, что выделенные в гипоталамусе рыб гона20 дотропины РЯН вЂ” LH/RH успешно заменяются указанными соединениями.

Инъецирование этими соединениями вызывает развитие спермы и икры, а также овуляцию.

Сущность способа получения пригодных для оплодотворения половых продуктов у половозрелых рыб в любое время года состоит в том, что у рыб исследуют половые продукты— икру и сперму и пд их состоянию устанавливают биологическую зрелость рыб.

Овуляционно зрелых рыб отбирают, отделяя их от незрелых, и вводят им путем инъекции соединение с гормональным действием, представляющее собой нонапептид С, а -алкиламиды или декапептидамиды общей формулы

С1р-His-Trp-Sar-Tyr-Х -Х -Х -Pro-X

2 3 аэ

40 где Х, — D-Phe, D-Trp, D-а1а, D-leu, D-Ser;

Х вЂ” Trp, Phe, или 1.еи;

Хз — Gln или Leu;

Ха. — GlyNHz или С, +-алкил ИН .

Рыбам могут быть введены также соли этих соединений.

Соединение вводят рыбам последовательно дозами, количество которых

50 составляет от 2 до 15.

Величина дозы, устанавливаемая в зависимости от вида соединения, составляет от 0,1 до 500 мкг/кг веса тела рыбы, при этом величина последней дозы равна величине предыдущей или превьппает ее в 1,5 раза.

Поскольку используемые соедине" ния нетоксичны, то превышение дозы не наносит никакого вреда.

1519522

Описываемый способ обладает следующими преимуществами: позволяет проводить искусственное размножение рыб, генетически 50 чуждых карпам, которых до сих пор не удавалось размножать иэ-за отсутствия специфических гипофизов рыб и их синтетических аналогов; может быть применен в широких

55 биологических границах окружающей среды, так как соединения общей формулы оказывают свое действие при различных биологических условиях;

При обработке рыб число инъекций в каждом случае зависит от того, насколько данная рыба подготовлена к икрометанию: чем ближе это состояние, тем меньше доэ препарата ей следует вводить.

После введения инъекций у рыб отбирают половые продукты, например, путем сцеживания, причем рыба 10 считается созревшей в том случае, если у самцов сперма активизируется тотчас же после соприкосновения с водой, а у самок — если клеточное ядро яйцеклетки находится в непосредственной близости от оболочки яйца. Отобранные половые продукты используют при искусственном рыборазведении.

Применяемые согласно описываемому способу соединения получают с помощью общепринятых методов синтеза пептидов в твердой фазе.

В зависимости от структуры желательного соединения в случае пептидалкиламидов исходят из хлорметилированных полистиролдивинилбенэольных смол, в случае амидов пептидных кислот — из бенэгидриламинных смол.

Отдельные аминокислоты в форме их N-n-бутилоксикарбонильных производных могут постепенно соединяться со смолой с помощью дициклогексилкарбодиимида, или диизопропилкарбодиимида, или с помощью соединения через активные сложные эфиры. ! (елевой продукт можно удалять с твердого носителя путем кислотного или щелочного отщепления. В зависимости от химического характера изменяемых частей аминокислот соединения общей формулы могут быть получены также путем соответствующих комбинаций постепенной (ступенчатой) конденсации и фрагментной конденсации из из45 вестных внастоящее время аминокислот. позволяет более полно использовать производственные мощности.

Действие препаратов, используемых при осуществлении способа, совпадает с действием собственных гонадотропинов рыб, причем эти препараты интерспецифичны, т.е. активны в случае генетически чуждых одни другим рыб.

Пример 1. Проводят искусственное размножение осетра (Acipenser

ruthenus) . Для этого из популяции рыб данного местообитания отбирают половозрелых рыб и транспортируют на станцию для размножения. Рыб сортируют по полу, затем определяют степень зрелости икры (яйцеклеток самок), относя к зрелым те из них, у

I которых клеточные ядра яйЦеклеток находятся на периферии. Степень зрелости самцов не определяют, так как в популяции рыб данного местообитания половые продукты самцов и самок находятся практически в идентичном состоянии, Рыбам, котовым к овуляции (самцам и самкам), вводят путем инъекции декапептид формулы

Glp-Нis-Trp-Ser- Tyr-D-Phe-LeuG1n-Pro-Gly-ИН в одноразовой дозе 70 мкг/рыба.

Если рыбы не созрели для овуляции, то их выдерживают при естественной температуре нереста, вводят соединения последовательно, двукратно, самое большее десятикратно, дозами по 10 мкг указанного соединения до тех пор, пока клеточные ядра не переместятся от центра к периферии; число обработок зависит от степени зрелости рыб.

Процесс созревания протекает при

15 С 100-650 градусодней.

Спустя 28 ч после введения: последней дозы происходит овуляция, а в последующие 50 мин получают половые продукты рыб.

Пример 2. Индуцируют нерест карпа (Gyprinus carpio Z), В любое время года и при любой температуре воды отбирают из популяции половозрелых рыб, которых транспортируют для размножения на станцию.

Рыб разделяют по полу и определяют состояние зрелости, как в примере 1.

Если рыбы зрелые, то самкам и самцам вводят декапептид формулы

1519 22

Glp-His — Тгр-Нег-Tyr-D-Phe-Тr рСeu-Рro-Г1у ИН . Не созревших для овуляции рыб выдерживают при естественной температуре нереста и обрабатывают по крайней мере двукратно или (самое большее) пятнадцатикратно указанным соединением в дозах по

5 мкг/рыба.

Процесс созревания при 22 С занимает от 100 до 750 градусодней.

Через 250 градусодней после введе ния последней дозы происходит овуляция. 3 течение 50 мин у рыб отцеживают половые продукты.

Пример 3. Осуществляют индуцирование нереста у окуней (Гегса

fluviatilis), для чего рыб отбирают так же, как в примере 1, а затем обрабатывают. самцов и самок декапептидом формулы Glp-His-Trp-Ser-D-Phe

Leu-Gln-Гго-Гlу NH в разовой дозе

20 мкг/рыба.

Несозревших рыб выдерживают при температуре нереста и обрабатывают по крайней мере двукратно или десятикратно, вводя указанное соединение в дозе 2 мкг/рыба. Процесс созревания при 14"С занимает от 100 до

400 градусоденй. Спустя 30 ч после введения последней дозы происходит икрометание. Окуни выметывают икру в бассейнах сами, что исключает отцеживание половых продуктов.

Пример 4. Проводят искусственное размножение макрели (Trachurus trachur«s), для чего из пойманных в ноябре месяце адриатических макрелей отбирают экземпляры длиной

24 см и транспортируют на станцию для размножения. Рыбы упомянутого размера являются половозрелыми.

Кождой рыбе вводят путем инъекции разовую дозу (10 мкг) соединения формулы Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-PheLeu-Gln-Pro-Гlу NH .

При температуре 21 С происходит овуляция в течение 24 ч.

В течение 2 ч проводят отцеживание половых продуктов.

Иэ таблицы видно, что каждое соединение действует в специфичных для него дозах, лежащих в пределах от

0,1 до 500,0 икг/рыба.

П р е р 5. Проводят индуцированное размножение щук (Esox lucius).

Рыб отбирают из популяции, транспортируют, разделяют по полу, как в примере 1. Созревшим для овуляции рыбам вводят такое же соединение с гормональными свойствами, как в примере 4.

Соединение вводят двукратно, самое большее 10-кратно в лозе по

5 мкг/рыба. о

Созревание рыб при 11 С занимает от 70 до 350 градусодней. Спустя 39 ч после введения последней дозы происходит овупяция. В ближайшие 5 ч отцсживают половые продукты.

П р и и е р 6. Проводят индуцированный нерест толстолобика (Hypopha1г>ychtys molitrix).

В отличие от примера 1, созревшим рыбам вводят декапептид С1р15

Hi s — Тгр — Ser-Tyr-D-Phe-Trp-l.eu-l гоГly-ИМ в одноразовой дозе 100 мкг/

/рыба. Не созревших для овуляции рыб выдерживают при естественной температуре нереста и обрабатывают от 2 до 15 раз (в зависимости ст степени зрелости) укаэанным соединением, которое вводят в дозе 10 мкг/рыба.

Прп этом величина последней дозы составляет 15 икг/рыба. Процесс созревания при 23 С занимает от 150 до 850" градусодней. Спустя 250 градусодней после введения последней дозы происходит овуляцпя ° .Затем половые продукты сцеживают.

Дальнейшие примеры осуществления способа с использованием соединения общей формулы приведены в табл.1 с указанием доэ, которые необходимо ввести для получения требуемого результата.

В таблице указаны только измененные члены аминокислот в соединении общей формулы

G1p-His-Trp-Ser-Tyr-X -Х -Х—

1, Pro †, 40

Согласно примерам, приведенным в табл.1, опыты проводили со стерлядью. Для каждой дозы и каждого соединения использовали 10 рыб. В таблице приведены данные покаэываю45 щие в процентах количество рыб, которые.овулировали после введения им соединения с гормональным действием.

Соединения, приведенные в табл.1 под N Ì 1, 4 и 5 очищены хроматографически, поэтому в данных примерах способ осуществляется с использованием солей этих соединений.

1519522

В табл.2 приведены физико-химические константы соединений, испольэуе-. мых для осуществления споСоба.

Формула изобретения

Способ получения пригодных для оплодотворения половых продуктов у половозрелых рыб в любое время года, предусматривающий определение биологической зрелости рыб путем исследования их половых продуктов, отделение овуляционно незрелых рыб от зрелых, введение зрелым рыбам путем инъекции соединения с гормональным действием и сбор полученных после инъекции половых продуктов, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью улучшения качества полученных половых продуктов и возможности их получения у рыб различных видов, в каТаблица!

Доза введения, мкг/вес тела в кг

Соединение

Glp-His-Тгр-Ser-! 2 3 4

-Туг-Х -Х -Х -Ргоз

5 6 7 8 9

-х, !

Пример

1,О 5,0 !0,0 25>0 50,0 !00,0 200 ° 0 300,0 500,0

0,5

0,!

60 90 90

30 30 50

О О О!

О !О 30 30

О О О О

О О О О

О

80 60 50

50 О О

20 О О!

3

30 О О

О О

20 40 40

О !

О

О О

О О

О О

О

40 50 80

О О О

О О О!

О О О

20 О О

О 20 20

О О

О О

О О

О О

30 20 20 !

О !О О

О !О 20

О О !О

О !

О

О

20 !

О

О

20 О О !

О О !О

30 30 !О

30 !О О

9 !

О !! !

О 20 1О

ЭО !О О

О 0

Таблица 2

Т. пл °, С

Угол оп- Растворитель тическоСоединение го вращения (K)D С

D-Yhe С1п -GnRH б Ь т Е

D-Phe -Тгр Leu

Trp <;1п -ГпКН т . г

175-178

180-184

160

D-Phe Gln

D-Phes Тгр Leu

Trpr Gln

Trp Leu des

Gly МН СпКНЕА

D-Phe Gln des

6 Ь

G 1y КН GnRHEA

Phe Leus

Phe Gln

Trp Сlп des

Gly МН GnRHEA

D-Trp Phe Leu

D-аlа С1п ь а

D-leu Gln

6 h

0-трет-бутил-Т!Ser Сlп честве соединения с гормональным действием рыбам вводят нонапептид—

С,-С -алкиламиды или декапептидамиды

5 об ще и формулы

Г1р-His-Тгр-Ser-Tyr-Õ -Х -Х -Pro! 2- Э

X49 ° где

Х, — D Phe, D-Trp, D-а1а, D-leu, D-Ser;

Х вЂ” Trp, Phe, Leu;

Хэ, — Gln или Leu;

Х+ — С1у ИН или С,-Се.-алкил МН или их соли, соединения вводят пос1ледовательно дозами, количество которых составляет 2 — 15, величину доз устанавливают в соответствии с данными, приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или превышает ее в 1,5 раза.

-58,0 0,1 0,1 н. уксусная кислота

-22,0 0,1 0,1 н. уксусная кислота

-12,0 0,1 0,1 н, уксусная кислота

)3!

15!9522

Продолжение табл. 2

1 в 1О

4 Trp Leu des Г1у

167-164 -5,9 0,5 0,1 н. уксусная кислота б s <о

D-Phe Gln des Г1у

СПРН-этиламид

Rhe Leu GnRH

1,0 !07-ная уксусная кислота

0,1 0,1 н. уксусная кислота

0,1 0,1 н. уксусная кислота

0,1 0,1 н. уксусная кислота

О, 1 О, 1 н. уксусная кислота

t,0 О, 1 н. уксусная кислота

1,0 0,1 н. уксусная кислота

1,0 0,1 н. уксусная кислота

181 — 183 — 10,2

175-178 -19, О

Phе Г1п GnRH

7 8

-21,0

182

7 8 1О

8 Trp Gln des 01у

Спи-зтиламид

D-Тгр Phe Leu

GnRH в

10 D-a la G l ï GnRH

179-180 -29,0

168-170 — 15,5

0,69

-32,3

182

0,55

11 D-Leu Сln GnRH

183-185 -35,0

0,57 б

12 0-трет-бут-D-Ser

G ln -GnRH

-23, О

1 78- 1 79

0,63 и!

Составитель С.Филиппова

Техред M.Õoäâíèö Корректор С, (ерни

Редактор А.Маковская

Заказ 6615/59

Подписное

Тираж 470

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101