Штамм бактерий рsеudомоnаs sp.,разлагающий нафталин и антрацен

 

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Pseudomonas sp. ВКПМ В-3343, разлагающий нафталин и антрацен . Штамм может быть использован для очистки сточных вод и загрязненных почв от этих соединений. Целью изобретения является получение нового штамма, способного с более высокими скоростями осуществлять деградацию нафталина и антрацена. При концентрации нафталина в среде 5 г/л его полное разрушение наблюдается через 4-5 суток. Полная деструкция антрацена при исходной концентрации 1 г/л происходит через 3 сут, при совместном содержании по 0,5 г/л оба субстрата отсутствуют в среде через 24 ч. i О)

СО)ОЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУЬЛИН (19) (11) А1 (Я) 4 С 12 N 1/20,,С 02 F 3/34 //

E(C 12 N 1/20, С 12 R 1:38) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма бактерий, способного к высоким скоростям разложения нафталина и антрацена, и который может быть использован для очистки сточных вод различных производств, а также почв, загрязненных этими соединениями.

Нафталин и антрацен являются ток- . сичными, высокоустойчивыми компонентами почв и сточных производственных вод, загрязняющими окружающую среду.

Целью изобретения является получение нового штамма, способного с более высокими скоростями осуществлять деградацию нафталина и антрацена.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ. СССР (21) 4289587/31-13 (22) 24.07.87 (46) 15.03.89. Бюл. У 10 (71) Институт биохимии им. А.Н. Баха (72) M.Ì. Якимов, Л.М. Циренина, A.Ñ. Вульман, И.В. Улезло и А.М. Безбородов (53) 663.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 785359, кл. С 02 Р 3/34, 1979.

EVANS M.Ñ., Fernley Н.N., Griffitha Е. OXYDATIVE МЕТАВ01Д$М

of PHENANTHRENE AND ANTHRACENE BY

S0I Ь P SEUDOMONAS ° ВТОСНЕМ. Л., 1965, v. 95, р. 819. (54) НТАМИ БАКТЕРИЙ РЗЕОЭОМОНАЗ, SP, °

РАЗЛАГА1 )ЩИЙ НАФТАЛИН И АНТРАЦЕН (57) Изобретение относится к микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Pseudomonas sp. BKIIM

В-3343, разлагающий нафталин и антрацен. Итамм может быть использован для очистки сточных вод и загрязненных почв от этих соединений. Целью изобретения является получение нового штамма, способного с более высокими скоростями осуществлять деградацию нафталина и антрацена. При концентрации нафталина в среде 5 r/ë его полное разрушение наблюдается через 4-5 суток. Полная деструкция антрацена при исходной концентрации

1 г/л происходит через 3 сут, прй совместном содержании по 0,5 г/л оба субстрата отсутствуют в среде через

24 ч.

Штамм Pseudomonas зр. ВКПМ В-3343 (рабочий номер 16 N2) выделен из сточных вод предприятий микробиологической промышленности с помощью метода длительной экспериментальной адаптации. Взятые активные илы помещались в минеральную среду, содержа-щую нафталин как единственный источник углерода и энергии в концентрации 1 г/л . Через 10 сут культивирования небольшую аликвоту (25 мл) переносили в свежую среду с нафталином. Подобные операции проводились до появления заметного роста микроорганизмов. Затем клеточную суспензию высевали на твердую минеральную среду с нафталином в соответствующем1465456 разведении для получения единичных колоний. У отобранных штаммов проверяли активность по разложению нафталина. Наиболее интересные высевали на среды, содержащие нафталин и антрацен. При обнаружении деградации антрацена культуры высевали на жидкие среды с антраценом, как единственным источником углерода и энергии. Штамм Pseudomonas sp. ВКПМ

В-3343 бып отобран как наиболее активный деструктор нафталина и антрацена, присутствующих в среде как вместе, TRK и отдельно.

Характеристика штамма Pseudomonas

sp. ВКПМ В-3343. Среды для хранения: МПА и минеральные среды с нафталином или тетрадеканом.

Морфологические признаки: парные палочки, слабоизогнутые,, длина клеток 1,2-2,4 мкм, ширина 0,8-0,9 мкм у 24 часовой культуры, выросшей на мясопептонном бульоне, грамотрицательные, подвижные, спор не образуют, размножаются делением.

Физиологические признаки: аэроб, а температурный оптимум +25 — "30 С, о P растет при +4 С, не растет при +42 С, ,оптимум рН 6,8-7,5.

Культуральные признаки: на мясо-пептонном агаре культура на третьи сутки образует круглые, S-формы колонии диаметром 2-3,5 мм, при росте на нафталине в минеральную среду выделяется темно-коричневый пигмент. 1?ост на мясо-пептонном бульоне с образованием пленки белого цвета и небольшим выделением газа.

Биохимические признаки: нитраты восстанавливает, желатину ,разжижает, крахмал не гидролизует, при росте на средах, содержащих органическую серу, выделяет сероводород, обладает оксидазной, каталазной и лнпазной активностью, при росте на среде "КИНГ А" выделение флуоресцирующего пигмента не наблюдается „усваивает сахарозу, глюкозу, фруктозу, ксилозу, арабинозу и рамнозу с образованием кислоты, подкисление среды не наблюдается при росте на мальтозе и лактозе, из спиртов ассимилирует этанол, глицерин, маннит, из алифатических углеводородов — соединения с длиной цепи от восьми до двадцати углеродных атомов, из ароматических углеводородов — пирокатехин, бензол, 10

Через 2 сут культивирования остаточное количество антрацена составляло менее 0,1% от исходного, на

3 сут антрацен в среде не обнаружен.

Одним из наиболее характерных метаболитов, обнаруженных в эфирном экстракте, являлась гидроксинафтойная кислота, что может служить доказательством микробиологического разложения антрацена. бензоат, толуол, м-ксилол, салицилат, бифенил и фенантрен.

Штамм Pseudomonas sp. BKlN В-3343 деградирует молекулы нафталина и антрацена, используя их в качестве единственных источников углерода и энергии, При концентрации нафталина в среде 5 г/л его полное разрушение наступает через 4-5 сут, при концентрации антрацена в среде 1 г/л процесс полной деструкции занимает около 3 сут, при совместном содержании по 0 5 г/л оба субстрата отсутствуют в среде через 24 ч.

Пример 1. Штамм Pseudomonas

sp. ВМПМ В-3343 выращивали в жидкой среде с нафталином в течение 3 сут.

Состав среды, г/л: КН РО 3,4;К НРО4

4,3 (1ЧНд)z SO 2з0ь, MgClz 0 26

СаС1 О, 026, ми кр о элементы, мг/л:

МпС1< 4HzO 1 „PeSOq 7HzO 0,6, Иа МоО 2Н О 2, нафталин 5 г/л,дистиллированная вода, рН 6,8-7,1.Через 3 сут культивирования нафталина в среде содержится менее 10Х от исходного, на 5 сут он в среде отсутствует.

Трехсуточной суспензией выросшей культуры засевали минеральную среду с антраценом (концентрация 1 г/л) .и выращивали на качалке при 200 об/мин в течение 2 сут, температура ферментации 28 С. Контроль за процессом разложения осуществляли с помощью методов газо-жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, для чего культуральную жидкость подкисляли

1 н НС1 до рН 2,0, экстрагировали диэтиловым эфиром, растворитель упаривали на роторном испарителе, тщательно высушенный остаток растворяли в 0,3 мл пиридина и добавляли

0,1 мл силирующего агента (N,O-бис, (триметилсилил)-трифторацетамид) . Наличие метаболитов выявляли на газожидкостном хроматографе и идентифицировали методом масс-спектрометрии.

Пример 3. В нижнюю часть нафталин в концентрации 5-10 мг/л. лабораторной установки, описанной в примере 2, перистальтическим насосом подавали синтетический сток, представляющий собой раствор антрацена Зо Штамм бактерий Pseudomonas sp. (5 мг/л) в водопроводной воде. Режим- .ВКПМ В-3343, разлагающий нафталин и эксплуатации установки тот же, что и антрацен.

Формула и зобр ет ения

Составитель 3. Фалунина

Техред М.Ходанич Корректор М. Демчик

Редактор 10. Середа

Заказ 910/28 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 14

Пример 2. В лабораторную установку аэротенк-биофильтр, представляющую собой колонку, загруженную волокнами триацетилцеллюлозы с иммобилизованными в них в процессе формования клетками Pseudomonas sp.ВМПМ В-3343 и совмещенного с ней аэротенка снизу перистальтическим насосом подавали син етический сток (раствор нафталина (40 мг/л) в водопроводной воде). Объем колонки

100 мл, скорость подачи жидкости

1 мл/с, аэрация 3, 3 мл/с, температура 20 С, рН 7,15. Установка эффективно работала весь испытательный срок, составляющий 60 сут, в выходящей воде содержание нафталина устойчиво не превышало 10 мкг/л. Микробиологический контроль чистоты используемой культуры, произведенный на 50 сут работы установки, показал отсутствие заражения биофильтрат побочной микрофлорой.

65456 6 в примере 2, рН 7,05. Установка рабо-. тала в течение 30 сут, в выходящей воде антрацена обнаружено не было.

Пример 4. В нижнюю часть лабораторной установки, описанной в примере 2, перистальтическим насосом подавали синтетический сток,состоящий, г/л: ацетон 0,1, этанол 0,2, бензол 0,1, нафталин 40, антрацен 5, аммонийные соли 2. Скорость подачи синтетического стока составляла

0,5 мл/с, рН 7,0. Установка работала в течение 30 сут, в выходящей воде нафталина и антрацена обнаружено не было °

Таким образом, предлагаемый штамм

Pseudomonas sp. ВМПМ В-3343, способный разлагать нафталин,и антрацен, 20 может быть использован для деграда» ции этих соединений при высоком их содержании в почвах или промышленных стоках, кроме того, новый штамм может быть применен в доочистке ряда

2В стоков, содержащих в выходящей воде