Способ получения смеси 5 @ -рибонуклеотидов из раствора нуклеиновых кислот, содержащего дезоксирибонуклеиновую кислоту
Изобретение относится к медицине , точнее к способам получения 5- рибонуклеотидов. Цель изобретения - предупреждение разложения дезоксирибонуклеиновой кислоты и упрощение способа. Для этого фермент 5 -фосфодиэстеразу иммобилизуют, образуя ковалентную связь между ферментом и полимерным носителем с каналами от 100 нм и объемом пор 2-3 м/г (например , эпоксидный носитель R, являющийся сополимером из глицидилметакрилата, аллилглицидилового эфирга, метакриламида и метилен-бис-метакриламида. Раствор природных нуклеиновых кислот, содержащий дезоксирибонуклейновую кислоту с мол.м, более 100000 и рибонуклеиновую с мол.м, менее 50000, пропускают через колонку с 5 -фосфодиэстеразой. Дпя получения инозинмонофосфата гидролизат пропускают через колонку с фиксированной на носителе 5 -дезаминазой. Результат соединения определяют, измеряя ферментативную активность на полимере и в промывочной воде. 1 з.п. ф-лы. СО
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (191 (Ш (Ю4, С 07 Н 21 00. l3 рцр тс g
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3494005/28 — 14 (22) 16.09,82 (3i) Р 3136940.5 (32) 17.09.81 (33) DE (46) 30.10.88. Бкл. Р 40 (71) Хехст АГ (DE) (72) Райнхольд Келлер и Иертен
Шлингманн (РЕ) (53) 615.45(088.8) (56) Патент Японии N - 53-20496, кл. С 07 С 103/85, 1978. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИ.СИ 5 -РИБОНУКЛЕОТИДОВ ИЗ РАСТВОРА НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ, СОДЕРЖАЦЕГО ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к способам получения 5 — рибонуклеотидов. Цель изобретения— предупреждение разложения дезоксирибонукленновой кислоты и упрощение
5358 АЗ способа. Для этого фермент 5 -фосфодиэстеразу иммобилизуют, образуя ковалентную связь между ферментом и полимерным носителем с каналами от
100 нм и объемом пор 2-3 м/г (например, эпоксидный носитель R, являющийся сополимером из глицидилметакрилата, аллилглицидилового эфира, метакриламида и метилен-бис-метакриламида.
Раствор природных нуклеиновых кислот, содержащий дезоксирибонуклеиновую кислоту с мол.м. более 100000 и рибонуклеиновую с мол.м. менее 50000, пропускают через колонку с 5 -фосфо1» диэстеразой. Для получения 5 — инозин1 монофосфата гидролизат пропускают через колонку с фиксированной на носи«1 теле з -дезаминазой. Результат соединения определяют, измеряя ферментативную активность на полимере и в промывочной воде. 1 з.п. ф-лы.
1435158
Изобретение относится к области
1 медицины, в частности к способам по пучения 5"-рибонуклеотидов.
Целью изобретения является предупреждение разложения дезоксирибонук" леиновой кислоты и упрощение способа
ba счет использования природных нукеиновых кислот, содержащих дезокси° ° ° ° ибонуклеиновую кислоту с мол.м. боее 100000 и рибонуклеиновую кислоту мол.м. менее 50000 °
Способ осуществляется следующим бразом.
Пример !. Фермент 5 -фосфоди- 15 стеразу иммобилизуют путем образоваия ковалентной связи между ферменом и полимернь м носителем, в качесте которого используют такие полимерые пористые носители, которые имеют аналы диаметром от 100 нм и объем: » ор 2-3 мл/г, предпочтительно 2,5 мл/г;, собенно хорошим носителем для 5 осфодиэстеразы является эпоксидный носитель (R) Ойпергит С, представяющий собой сополимер из глицидилметакрилата, аллилглицидилового эфи ра, метакриламида и метилен-бис-мет акрпламида. Фермент соединяют с поли мерным носителем при условиях,. не влияющих на стабильность фермента. 1Результат соединения определяют путем измерения ферментативной активности на полимере и в промывочной воде. роцесс осуществляют следующим обазом.
2 г 5 -фосфодиэстеразы (нуклеазы
R р, фирма Лмано) растворяют в 80 мл
1 М буферного раствора фосфата с рН
7,8, Раствор подают в колонку, содер кащую 20 r эпоксидного носителя ("Ой- " пергит С") с каналами диаметром до
100 нм и .объемом пор 2-3 мл/г, слег.ка перемешивают и оставляют на 3 дня при комнатной температуре. Полимерную смолу отфильтровывают и промывают следующими жидкостями: бидистиллятом;
1 И раствором NaHCO, . 0,5 1f раствором NaC1; бидистиллятом; 1 N раствором НС1; бидистиллятом. Промытую смолу помещают в 0,05 II ацетато-буферный раствор и загружают в стеклянную колонку с двойной рубашкой диаметром 2,6 и высотой 20 см. Для измерения активности иммобилизованной
5 -фосфодиэстеразы субстрат-раствор, 55 состоящий из 4% РНК и 0,1 мИ раствора сульфата цинка и 0,05 N ацетата буферного раствора с рИ 4,5, пропускают через колонку со скоростью протекания (SV) 20-30h при 55 С ° Количество мононуклеоо тидов определяют фотометрически с помощью жидкостной хроматографии на колонке RP ("гечегзе4 рЬязе" сили18 кагель, гидрофобизированньп» ялифатическими соединениями с углеводной цепочкой, содержащей до 18 атомов углерода). Злюирование осуществляют водой, подкисленной фосфорной кислотой до рН 2,1, при скорости потока 2 мл/
/мин. Проявление осуществляют с помощью УФ-излучения с длиной волны
254 нм.
Пример 2. Водный раствор, содержащий 0,9% (вес/объем) природной нуклеиновой кислоты, в котором количество РИК и ДНК находится в соотношении 4:1 и ДНК имеет мол.м. более
100000, à РНК вЂ” менее 50000, доводят до рН 4,5 ледяной уксусной кислотой и пропускают через колонку с иммоби1 лизованной 5 -фосфодиэстеразой (согласно примеру i) при 55 С. Скорость потока через колонку регулируют таким образом, чтобы осуществлялось
100%-ное превращение РИК, Для выделения 5 -рибонуклеотидов разрушенный раствор нуклеиновых кислот пропускают через колонку, заполненную слабоосновной ионообменной смолой РБО1.?ХЕ
Л 7 в ацетатной форме. Для очистки и выделения ДИК элюат с колонны концентрируют с помощью RONICON-патронов с полым волокном (полисульфоновое волокно, граница выделения 100000) и подвергают диализу по отношению к воде,. не содержащей солей. Через мембрану могут проходить молекулы с молекулярным весом менее 50000. ДНК осаждают, доводя рН раствора до 2,0 и после высушивания получают. в виде белого порошка. Отделение смеси 5 — рибонуклеотидов осуществляют путем селективной десорбции ацетатными ра" створами повышающейся концентрации:
CNP: 0,1 н. уксусная кислота; А11Р:
0,3 н. уксусная кислота; ЧМР: 0,4 н. ацетат аммония; С11Р: 0,5 и. ацетат аммония. Общий выход 5 -рибонуклеотидов 75-80%.
П р .и м е р 3. Водный раствор, содержащий 3% (вес/объем) природной нуклеиновой кислоты, в котором количество РНК и ДИК находится в соотношении 4:1 и ДНК имеет мол.м, более
100000, а РНК вЂ” менее 50000, доводят гq 4 ! (ой! к >(с. (о т(1>! . (>(. аж>!е н>(ую, (((К Отф>! >! ьт ровывают >! вы(у(шп!ают.
Общий вьтад смеси 5 -рибонуклеотндов, содержащей;(НК, составляет 75807,.
Таким образом, способ получения !
5 -рибонуклеотидов не требует предварительной очистки РНК и тем самым не влечет за собой разрушение ДНК °
Кроме того, раствор, полученный гидролиэом наряду с 5 -рибонуклеотидами и неразрушенной ДНК содержит также еще примеси протеинов и солей ферментов, которые можно выделять очисткой.
Раствор, полученный гидролизом природных нуклеиновых кислот, содержащий также 5 -аденозинионофосфат, можно использовать непосредственно для получения 5 -иноэинмонофосфата,, 1 применяемого в качестве усилителя вкусовых свойств, при этом не требуется предварительное выделение ДНК. (1. Способ получения смеси 5 -рибонуклеотидов из раствора нуклеиновых кислот, содержащего дезоксирибонуклеиновую кислоту, путем гидролиэа рибонуклеиновой кислоты с последующим выделением продукта ионообменной или адсорбционной хроматографией, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью предупреждения разложения дезокси" ибонуклеиновой кислоты и упрощения пособа, раствор природных нуклеиноых кислот, содержащий дезоксирибо уклеиновую кислоту с мол.м. более
00000 и рибонуклеиновую кислоту с (ол.м. менее 50000, пропускают через
I олонку с 5 -(>>осфодиэстеразой, предарительно иммобилизованной .на макроористом полимерном носителе с канаами диаметром до 100 нм и объемом ор 2-3 мл/г.
2. Способ по п.), о т л и ч а ю-! и и с я тем, что для .получения
-иноэинмонофосфата: гидролизат ропускают через колонку с фиксиро-! анной на носителе 5 -дезаминазой. ина л Корректор А.Обручар
35 р
П.р и м е р 4. Водный раствор 2% (вес/объем) природной нуклеиновой кис- в лоты (PHK) ДНК 1:1, мол.м. ДНК более н
100000, PHK — менее 50000) обрабаты- 1 вают., по примеру 2 и для разложения
40 ! пропускают через колонку с иммобили- к зованной 5 -фосфодиэстеразой. Элюат в с помощью NaOH доводят до рН 8,5 и и с целью адсорбции нуклеотидов пропус- л кают через колонку, заполненную силь- п .45 ноосновным анионообменником IR А 4000 (хлоридной формы). Элюат с ионитовой (! колонки концентрируют с помощью мем" 5 бран н-" эснове полых волокон и дово- . п л". (- (о 2,0 концентрированной соля- 50 в
Составитель Л.Шил
Редактор О.Спесивых Техред М.Моргента
Заказ 5568/59 Тираж 348 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
3 1 (3 > l
pH gin 4, 5> ле,(>! ((о(! уксусной кислотой о, и при 55 С пропускают чере колонку ,— I с иммобилизованной 5 -фосфодиэстеразой согласно примеру 1. Скорость потока через колонку регулируют таким
5 образом, чтобы осуществлялось 100%ное превращение PHK (например, при активности 265 r PHK на 1 л фиксированного фермента в час раствор про- 10 пускают через колонку с помощью насоса со скоростью 2,12 л/ч). В полученном растворе содержится также 5 -аденозинмонофосфат. Для получения из ! него 5 -инозинмонофосфата раствор пропускают через вторую колонку с им-! мобилизованной 5 -дезаминазой (также согласно примеру 1). Элюат с колонки концентрируют с помощью мембран на основе полых волокон и прошедшую че- 0 рез мембрану часть доводят до рН 1,52,0 концентрированной соляной кислотой, затем пропускают через колонку, заполненную гранулированным активированным углем, адсорбируют 5 -рибо- 25 Ф î р м у,л а и з о б р е т е н и я нуклеотиды. Из оставшейся части при рН 2,0 осаждают ДНК и затем высушивают. Выделение смеси 5 -рибонуклеотидов осуществляют путем селективной десорбции щелочными метанольными раст З0 ворами следующего состава: 50 об. ч. метанола, 49 об.ч. воды и 1 об.ч. концентрированного водного раствора аммиака. Общий выход 51-рибонуклеотидов 75-80Х.
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
