Способ получения иммобилизованных протеиназ

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к способу иммобилизации протеолитических ферментов, и может найти применение в медицине при получении препаратов иммобилизованных ферментов для лечения ран и ожогов. Целью изобретения является увеличение протеолитической активности препарата иммобилизованного фермента . Способ заключается в связывании различных протеолитических ферментов на полисахаридном носителе, в качестве которого используйт полиангидроглюкуроновую кислоту. Проведение связывания в узкоь интервале рН (рН 4,4-4,6) позволяет достигнуть максимальной активности целевого продукта , сохранить при этом физическую форму полиангидроглюкуроновой кислоты . 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„140 1

А1 (51) 4 С 12 М 11/06

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /" :

Н A BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3853060/31-13 (22) 01. 02. 85 (46) 30,06 ° 88. Бюл. и 24 (71) Научно-исследовательский институт физико-химических проблем Белорусского государственного университета им. В.И. Ленина и Белорусский научно-исследовательский санитарногигиенический институт (72) В.А.Алиновская, Ф.Н.Капуцкий, Т.Л.Юркштович, В.М.Талапин и В.А.Стельмах (53) 577. 15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 950770, кл. С 12 N 9/48, 1980.

Иммобилизованные ферменты/Под ред.

И.В.Березина и др., M.: МГУ, 1976, т.2, с. 292-293. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРОТЕИНАЗ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу иммобилизации протеолитических ферментов, и может найти применение в медицине при получении препаратов иммобилизованных ферментов для лечения ран и ожогов. Целью изобретения является увеличение протеолитической активности препарата иммобилизованного фермента. Способ заключается s связывании различных протеолитических фер" ментов на полисахаридном носителе, в качестве которого используйт полиангидроглюкуроновую кислоту. Проведение связывания в узкой интервале рН (pH 4,4-4,6) позволяет достигнуть максимальной активности целевого продукта, сохранить при этом физическую форму полиангидроглюкуроновой кислоты. 1 табл.

1406161

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу иммобилизации протеолитических ферментов, и может найти применение в медицине при получении препаратов иммобилизованных ферментов для лечения ран и ожогов.

Цель изобретения — увеличение протеолитической активности иммобилизованных протеиназ. 10

Способ заключается в адсорбции различных протеиназ на полиангидроглюкуроновой кислоте при рН 4,4-4,6.

При данных значениях рН достигается максимальное увеличение протеолити- 15 ческой активности и выхода фермента, а снижение и увеличение рН до 4 или

5,соответственно, приводит к резкому снижению активности, При этом количе ство связанного с матрицей белка 20 практически не изменяется (таблица) .

Способ позволяет увеличить протеолитическую активность целевого продукта, использовав при этом доступный и нетоксичный носитель. 25

Пример 1, К 1 r полиангидроглюкуроновой кислоты (содержание карбоксильных групп 14,6%) приливают раствор, содержащий 0,5 r трипсина в

50 мл буфера с рН 4,4 (15 мл 0,1 н. 30

Na0H+50 мл 0,2 М КНСЭН О +Н О до

200 мл), выдерживают в этом растворе в течение 24 ч при 10 С, извлекают образец из раствора, переносят его на воронку Бюхнера, промывают после-. довательно охлажденным до 10 С буфео ром с рН 4,4, дистилированной водой до исчезновения в промывных водах реакции на трипсин. После этого образец иммобилизованного трипсина промы- 40 вают смесью вода — ацетон (1:4 по объему), ацетоном и высушивают на воздухе до воздушно-влажного состояния. Активность иммобилизованного трипсина по субстрату S-test proteaza<5

universal составляет 9020 ед/г. Образец полностью сохраняет физическую форму исходной полиангидроглюкуроновой кислоты.

Пример 2. К 1 r полиангидроглюкуроновой кислоты приливают раствор, содержащий 0 5 г трипсина в . 50 мл буфера с рН 4,5 (47 мл 0,1 н.

Na0H + 50 мл 0,2 М КНС8Н О +Н О до

200 мл). Дальнейшую обработку прово55 дят, как в примере 1. Активность иммобилизов анно го трипсина, определяе- мая по субстрату S — test proteaza .universal, составляет 10518 ед/г.

Образец полностью сохраняет физическую форму полиангидроглюкуроновой кислоты.

Пример 3. К 1 г полиангидроглюкуроновой кислоты приливают раствор, содержащий 0,5 г трипсина в

50 мл буфера с рН 4,6 (90,9 мл 0,1 н.

Na0H + 50 мл 0,2 M КНС8Н О +Н О до

200 мл). Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного трипсина по субстрату

S-test proteaza universal составляет

9847 ед/г. Образец полностью сохраняет физическую форму исходной полиангидроглюкуроновой кислоты.

Пример 4. К 1 г полиангидроглюкуроновой кислоты приливают раствор, содержащий 0,5 г химотрипсина в 50 мл буфера с рН 4,5 (47 мл 0,1 н.

NaOH добавляют к 50 мл 0,2 М КНС Н О и доводят дистиллированной Н О до

200 мл). Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Активность иммобилизованного химотрипсина по субстрату S-test proteaza universal составляет 9600 ед/г.

Пример 5. К 1 г полиангидроглюкуроновой кислоты приливают раствор, содержащий 0,5 г фибринолизина в 50 мл буфера с рН 4,5 (47 мл О, 1 н.

Na0H добавляют к 50 мл 0,2 М КНСВН О и доводят водой дистиллированной до

200 мл). Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Активность им.мобилизованного фибринолизина составляет 9010 ед/г.

Проведение иммобилизации протеолитических ферментов полиангидроглюкуроновой кислотой при рН раствора, лежащих за пределами данного интервала (4,4-4,6), приводит к резкому уменьшению активности. Так, например, активность иммобилизованного трипсина, полученного при рН 4,0 и 5 0 составляет 4660 и 2740 ед/г соответственно.

При этом увеличение рН больше, чем

4,6, приводит к потере физической формы полиангидроглюкуроновой кислоты. Дальнейшее увеличение рН приводит к повышению активности иммобилизованного фермента (таблица).

Удельную активность рассчитывают по формуле

А 100

А

Сф А„,„

4.

Иммобилизация трипсина

140616

- где А — активность препарата иммобилизованного фермента, ед/г носителя;

Сф — содержание иммобилизованного

5 фермента, г, в 1 г носителя;

А„с„- активность нативного фермента, ед/г.

А

Величина -- — представляет собой с 10 активность 1 г иммобилизованного фермента, т.е. А» относится к 1 г иммобилизованного фермента.

Для химотрипсина и фибринолиэина получены закономерности, аналогичные 15 приведенным в таблице.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет увеличить протеолитическую активность иммобилизованных ферментов до 50-54Х по срав-20 нению с 40Х для известных способов (в расчете íà tr иммобилизованного фермента). .формула изобретения

Способ получения иммобилиэованных 25 протеиназ, заключающийся в их связывании с полисахаридным носителем с .последующим отделением целевого про дукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения протеолитической активности целевого продукта и его выхода, в качестве носителя используют полиангидроглюкуроновую кислоту, а связывание проводят при

- рН 4,4 — 4,6.

Содержание свяОбщая активность (А),ед/г носителя

Удельная активность (Ау4), Х занного фермен" та, r/r носителя рн

9,6

0,085 760

0,172 2990

0,193 4660

0,191 9020

Ор 196 10518

2,6

18,6

3,5

4,0

25,8

51,0

4,5 4,6 "

57,3

9847

О, 197

0,201

0,200

0,202

О, 199

0,201

14,6

2740

5 0

5520

5 6

29,5

8150

43,1

6,0

8840

7,4

47,5

47,1

8860

8,0

+По примеру 1;

+ По примеру 2; + Ilo примеру 3.

Составитель В.Муронец

Редактор Н.Киштулинец Техред А.Кравчук Корректор И.Эрдейи

Заказ 3157/23 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4