Способ определения холестерина в крови

 

Изобретение относится к медицине , точнее к электрохимическим способам анализа концентрации холестерина в крови путем измерения тока ферментных реакций при электролизе. Цель изобретения - упрощение способа за счет исключения стадий. Для этого проводят электролиз исследуемой пробы цельной крови в фосфатном буфере,содержащем зтилендиаминтетраацетат,хлористый калий, нативную холестеролоксидазу, азид натрия и детергент, в качестве которого применяют дезоксихолат натрия. Для осуществления способа используют измерительную ячейку, состоящую из корпуса, входного и выходного патрубков для промывки, измерительной камеры, в которую помещены рабочий Pt-электрод, покрытый 32- слойной мембраной, и Ag/AgCl-электрг)Д сравнения с отверстием для введения пробы и фермента. Под действием фермента окисляется холестерин, вьщеляется перекись водорода. Электрохимическое ее окисление на Pt-аноде при 0,6 В отн.насыщ. Ag/AgCl-электрода сравнения генерирует анодньсй ток, величина которого пропорциональна концентрации холестерина. 4 табл. 2 ил. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19> (11) А1 (5Н4 (01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ р(: к

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4074931/28-14 (22) 21.04.86 (46) 07.03.88. Бюл. 1(9 (7 1) Институт биохимии АН ЛитССР и Всессюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и (рерментов медицинского назначения (72) Ю.IO. Кулис, М.В. Песлякене, В-С.А. Лауринавичюс, Л.Я. Петрова, О.И. Глубоковская и А.А. Селезнева (53) 612.015(088.8) (56} Clark L ° C. et al, Clin, Chim, 1981, т. 27, к 12, с. 1978-1982, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА

В КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к электрохимическим способам анализа концентрации холестерина в крови путем измерения тока ферментных реакций при электролизе ° Цель изобретения — упрощение способа за счет исключения стадий. Для этого проводят электролиз исследуемой пробы цельной крови в фосфатном буфере,содержащем этилендиаминтетраацетат,хлористыи калий, нативную холестеролоксидазу, азид натрия и детергент, в качестве которого применяют дезоксихолат натрия. Для осуществления способа используют измерительную ячейку, состоящую из корпуса, входного и выходного патрубков для промывки, измерительной камеры, в которую помещены рабочий Pt-электрод, покрытыи 32слоиной мембраной, и Ag/AäC1-электрод сравнения с отверстием для введения пробы и фермента. Под действием фермента окисляется холестерин, выделяется перекись водорода. Электрохимическое ее окисление íà Pt-аноде при 0,6 В отн.насьпц. Ag/AgC1-электрода сравнения генерирует анодный ток, величина которого, пропорциональна концентрации холестерина. 4 табл.

2 ил.

1 3797 ЗЬ

Изобретение отнссится к медицине, н частности к электрохимическим способам анализа концентрации холесте— рина н крови путем измерен я тока

5 фермен .ньх р акций при электролизе.

Цель изобрс тения — упрощение спос.оба эа счет исключения стадий.

На фиг. 1 изображена схема измерительнои ячейки; на фиг, 2 — калибро- 1р вочный график зависимости тс ка оТ концентрации холестерина.

Измерительная ячейка для осуществления способа(фиг.1)состоит иэ корпуса

1,изготовленного из органического стек-15 ла и содержащего входной и выходной патрубки для промывки и заполнения ячейки буферным раствором, и измерительной камеры 2 с магнитнои мешал— кой 3 н которую помещены рабочий 20

Pt-электрод 4, покрытый трехслойной мембраной 5, п Ag/АрС1-электрод 6 сравнения, и которая содержит верхнее отверстие для введения пробы и фермента. 25

Трехслоинля мембрана 5 изготовлена по известной методике с использованием лансановой мембраны проницаемостью 10,77. и диаметром пор 0,54 мкм, полупроницаемои ацетатцеллюлозной 30 мембраны, а вместо. ферментатинного слоя находится иммобилизованный альбумин. Промывка и заполнение ячейки буферным раствором осуществляется при помощи двухканального перистальтичес35 кого насоса. Рабочий и вспомогательный электроды присоединены к полярографу с самописцем.

В измерительную ячейку, содержащую буферный раствор, вводят 0,02 мл ра- 40 створа холестерина и через 10 с

0,05 мл раствора холестеролоксидазы.

Под действием фермента окисляется холестерин и выделяется перекись водорода. Электрохимическое ее окисле45 ние на Pt-аноде при 0,6 В относительно насыщенного Ag/АцС1-электрода сравнения генерирует анодный ток, величина которого пропорциональна концентрации холестерина. Платиновый электрод отделен от реакционной смеси трех- слойной защитной мембраной, что обеспечивает отсутствие фоновых токов и при введении пробы крови в ячейку.Изменение фонового тока в 50-кратно разбавленной крови не превышает 1-27. 55

Поэтому концентрацию холестерина в крови определяют по калибровочному графику для чистого раствора. После анализа ячеика промывается в течение

1,5 мин струей буфера, после чего можно проводить следующее измерение.

Пример 1. Определение зависимости величины стационарного тока электрода от концентрации холестеролоксидазы. Злектролиз раствора проводят в присутствии 0,2 мМ холестерина в ячейке в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 0,1 M KC1, 1 мМ

ЭДТА, 0,27. дезоксихолата натрия и

5 мМ азида натрия. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Данные табл. 1 показывают, что резкая зависимость тока от концентрации ферме н та наблюдается до О, 33 ед/ мл .

Пример 2. Определение зависимости стационарного тока электрода от концентрации холестерина.

Проводят электролиз в присутствии

0,33 ед/мл холестеролоксидаэы. Другие условия, как в примере 1. Степень разбавления образцов в ячейке — 50 раз.

Результаты приведены в табл.2.

Из табл. 2 видно, что в интервале концентраций холестерина 1-10 мМ наблюдается прямолинейная зависимость тока от концентрации. По данным табл. 2 строят калибровочный график, используемый затем при определении холестерина в крови (фиг. 2).

Пример 3. Определение зависимости стационарного тока от концентрации азида натрия.

3лектролиэ раствора проводят в присутствии 20 мкл крови, 0,40 ед. холестеролоксидаэы в буферном растворе, содержащем 0,227. дезоксихолата натрия и азид натрия в интервале концентраций 2-14 мМ. Другие условия электролиза, как в примере 1.

Результаты приведены в табл. 3.

Из данных табл. 3 видно, что при определении холестерина в крови при

1 увеличении концентрации аэида натрия до 3,0-4,0 мМ ток электрода увеличивается, в интервале концентраций

4,0-7,0 не меняется, а в дальнейшем начинает падать. При измерении холе терина в водных растворах в этом интервале концентраций аэида ток практически не меняется. Таким образом, при реализации способа применяется

4-7 мМ азида натрия в буферном раст норе, 1379738

Холестеролоксидаэа, ед,. /мл (смз ) 0,033 0,066 0,132 0,198 0,264 0,33 0,50

Ою,06 0 12 0,23 0 275 0 29 0130 Оэ305

Ток электрода, мкА

Т а б л и ц а 2

Концентрация холестерина, мМ

002 004 008 0,1 0,12 0,16 О,?

30,5 59,2 118,0 148,0 181,0 238,0 292,0

Ток,нА

Т а б л и ц а 3

Концентрация азида натрия, мИ

20 25 30 40 50 70 90 11,0 14Г) Ток электрода, нА 40,0 45,0 49,0 51,0 52,0 52,0 48,0 45,0

40,0

Таблица 4

Концентрация деэоксихолата натрия, 0 1 0,15 0,18 0,20 0,22 0,30 0,40 0,60 0,80 1,О

15 35 50 48 40 35 30 25

Ток электрода, нА

Пример 4. Определение за— висимости стационарного тока от концентрации де зоксихолата натрия.

Электролиэ раствора проводят,в присутствии 20 мкл крови, 0,50 ед. холестеролоксидаэы в буферном растворе, содержащем 7 мМ азида и 0,11,ОХ дезоксихолата натрия. Другие условия, как в примере 1. Результаты приведены в табл. 4.

Данные табл. 4 показывают, что при определении холестерина в крови наибольший ток наблюдается при концентрации деэоксихолата натрия 0,180,22%.

Ф о р м у л а и з о б р т е и и я

Способ определения холестерина в крови, Bêëþ÷àþùèé элеKтроли3 исследуемой пробы в фосфатном буфере, содержащем этилендиаминтетраацетат, хлористый калий„нативную холест ро. оксидазу, аэид натрия и детергент с последующей регистрацией в ли ины анодного тока в сравнении с контролем, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа эа счет исключения стадий, электроли ló подвергают пробу цельной крови, в качестве детсргента применяют дезс ксихолат натрия -, конпентрации 0,18

0,22 мас.7,а холестеролоксидаэ и азии натрия используют в концентрации О, 3—

-0,5ед./см и 4-7мМ соответственно.

Т а б л v ц а 1! 3797 18

300

700

004 008 ц 12 0 1Б 4 Ю (олестерин), иМ Ь яжй е

Щг. Г

Составитель А. Агуреев

Техред М.Дидык Корректор С. Шекмар

Редактор В. Данко

Заказ 977/48

Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета ГССР цо дpJIBM Hçîáðåòåíèé и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Произкод твенн«-и лиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4