Способ количественного определения компонентов фламина

 

Изобретение относится к фармакологии . Цель изобретения - повышение точности способа. Смешивают анализируемый раствор фламина в системе вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран и раствора салициловой кислоты. Пробу полученной смеси вводят в колонку жидкостного хроматографа . Элюентом для разделения содержащихся во фламине гликоэидов служит система вода - ацетонитрил - уксусная кислота. Для детектирования применяют ультрафиолетовый детектор. По полученным .хроматограммам определяют соотношение площади пика каждого компонента и внутреннего стандарта и рассчитывают содержание отдельных компонентов фламина. 5 табл. ф (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (584 G 01 N 33 15

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ.(21) 3981756/28-14 (22) 26 ° 11.85 (46) 30.08,87. Бюл. 1(- 32 (7 1) 1-й Московский медицинский институт им. И.М, Сеченова и Всесоюзный научно-исследовательский институт химии и технологии лекарственных средств (72) Н.А. Тюкавкина, В.Е. Ручкин, Ю.А. Колесник, И.А, Руленко и В.П.Георгиевский (53) 612.015(088.8) (56) Георгиевский В.П. Контроль качества фитохимических препаратов и растительного сырья физико-химическими методами. — Труды II съезда фармацевтов УССР. Киев, 1974, с. 122-130 ° (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ФЛАМИНА (57) Изобретение относится к фармакологии. Цель изобретения — повышение точности способа. Смешивают анализируемый раствор фламина в системе вода — ацетонитрил — уксусная кислота— тетрагидрофуран и раствора салициловой кислоты. Пробу полученной смеси вводят в колонку жидкостного хроматографа. Элюентом для разделения содержащихся во фламине гликозидов служит система вода — ацетонитрил — уксусная кислота. Для детектирования применяют ультрафиолетовый детектор. По полученным.хроматограммам определяют соотношение площади пика каждого компонента и внутреннего стандарта и рассчитывают содержание отдельных

С: компонентов фламина. 5 табл.

1334077 где S в.с площадь пика компонента; площадь пика внутреннега стандарта; коэффициенты пропорциональности, определенные па калибровочным графикам компонентов;

Изобретение относится к медицине, в частности к способам количестг енного определения компонентов фламина, являющегося смесью гликозидов и агли-конов флавоноидной природы и применяемого в качестве желчегонного средства при заболеваниях печени и желчного пузыря.

Цель изобретения — повышение "o÷- 10 ности определения.

Поставленная цель достигается тем, что в анализируемый раствор фламина вводят внутренний стандарт - раствор салициловой кислоты и смесь подвергают хроматографическому разделению последовательно в системах вода— ацетонитрил — уксусная кислота — тетрагидрофуран (71,5:20 .5:3,5) и вода— ацетонитрил — уксусная кислота (12: 220

:7:1) .

Способ осуществляют следующим об,разом.

Смешивают равные объемы анализируемого раствора фламина в системе

1 вода — ацетонитрил — уксусная кис.лота — тетрагидрофуран 71,5:20:5:3,5 и раствора салициловой кислоты определенной концентрации в той же системе. Пробу полученной смеси вводят 30 в колонку жидкостного хроматаграфа, наполненную силикагелем размером

5-10 мкм с поверхностно-привитыми углеводородными радикалами С -С,8.

Элюентом для хроматографическога раз- З> деления содержащихся во фламине гликозидов служит система I агликонов— система II вода — ацетонитрил — уксусная кислота (12:7:1), Для детектирования применяют ультрафиолетовый 4П детектор с переменной длиной волны, используемый в интервале 290-320 нм.

Из полученных хроматограмм определяют соотношение площади пика каждого компонента и внутреннего стандарта, кота- 4> рое не зависит от величины введенной пробы и скорости потока элюента.Процентное содержание отдельных компонентов фламина рассчитывают по формуле

00 () - @ а — концентрация субстрата фламина в анализируемом раства ре (мкг/мл);

Ь вЂ” отрезок,, отсекаемый калибровочной кривой на оси ординат.

Для определения коэффициентов пропорциональности отдельных компонентов фламина строят калибровочные графики зависимости Б,/Sв, ат C., где S /Se — отношение плошадей пикав каждого индивидуального компонента фламина на хроматограмме и салициловай кислоты;

С вЂ” концентрация компонента в растворах серии с внутренним стандартом.

Для построения графиков берут точную навеску каждого индивидуального компонента фламина и готовят путем разбавления системой I серию из пяти растворов различной концентрации, Внутренний стандарт готовят растворением

0,04 г салициловай кислоты очищенной возгонкой в 100 мл системы I в мерной колбе вместимостью 500 мл с последующим доведением до метки той же системой растворителей. Затем смешивают по 1 мл раствора определенной концентрации каждого индивидуального компонента фламина и раствора внутреннего стандарта и проводят хроматаграфи" ческий анализ этой серии растворов в ступенчатом режиме; в "èñòåìå Х -13 мин, в системе II — 13-30 мин, Обоснование параметров способа представлена в табл. 1, П р и и е .р 1, Количественное определение кемпфеpolIÇ-глюкозида ва фламине.

Анализ кемнферол-3-глюкозида начинают с построения калибровочного графика. Для этого 20 мг хроматографически чистого кепмферал-3-глюкозида взвешивают на весах типа ЯагСагш и растворяют в 10 мл системы I.. Из полученного раствора путем разбавления системой I готовят растворы кемпферол-3-глюказида с концентрациями

20, 40, 60, 80 и 100 мкг/мл, К 1 кажДого из pacTBQpoB добавляют па

1 мл 0,0087.-ногс раствора салицилавай кислоты (внутренний стандарт). Полученные растворы поочередно вводят в колонку жидкостного храматографа, и хроматографический анализ растьора каждой концентрации повторяют пять раз, Для анализа испоЯьзуют жидкостный храматаграф фирмы "Spectra Phy1334077

sics" дозировочный кран с петлей объемом 10 мкл, хроматографическую колонку, наполненную адсорбентом

5fucleosil RP-18 с размером частиц

10 мкм, детектор SP-8400 при длине волны 315 нм, Скорость потока элюента — системы вода — ацетонитрил— уксусная кислота — тетрагидрофуран (71,5:20:5:3,5) 1 мл/мин. Площади пи- 1О ков кемпферол-3- глюкозида и салициловой кислоты на хроматограмме измеряют с помощью интегратора SP-4100.

Строят калибровочный график, откладывая Я„/Я,против величин С„. Коэффициент К, определенный по калибровочной кривой, равен 0,053+0,004; Ь равно-0,107.. Исследуемйй образец фламина (20 мг) серии 26084, растворяют в 10 мл системы I. К 1 мл этого ра- 20 створа добавляют 1 мл 0,0082-ного раствора салициловой кислоты, пробу полученной смеси вводят в колонку хроматографа и проводят пятикратный анализ в ступенчатом режиме: система 25

1" 13 мин, система II — 13-30 мин;

Из хроматограмм находят площади пиков кемпферол-3-глюкозида и салициловой кислоты, рассчитывают их соотношение (S„/S ) и по формуле (1) оп- 30 ределяют процентное содержание кемпферол-3-глюкозида (табл. 2) .

Содержание кемпферол-3-глюкозида в данном образце фламина 13,55+0,80Х.

Пример 2. Количественное оп- З5 ределение изосалипурпоэида во фламине.

Анализ изосалипурпозида начинают с построения калибровочного графика.

Для этого 20 мл (точная навеска) хро- 40 матографически чистого .изосалипурпозида растворяют в 10 мп системы: I. .Из полученного раствора путем разбавления системой I готовят растворы с концентрациями 40, 80, 120, 160, 45

200 мкг/мл, К 1 мл каждого из растворов добавляют по 1 мл 0,0081-ного раствора салициловой кислоты (внутренний стандарт), т.е. исходный раствор разбавляют в 2 раза. Полученные 5р растворы изосалипурпозида с концентрацией 20, 40, 60, 80, 100 мкг/мл поочередно вводят в колонку жидкостного хроматографа, и анализ раствора каждой концентрации повторяют

5 раз. Условия хроматографического анализа и оборудование аналогичны приведенным в примере 1. По данным хроматографического анализа, приведенным в табл. 3, строят калибровочный график, откладывая на оси кординат отношения площадей пиков изосалипурпозида и внутреннего стандарта (Я /Sz ), а на оси абсцисс — концентрация изосалипурпозида (С„ ). Коэффициент К, определяемый как тангенс угла наклона калибровочного графика, равен 0,058; величина отрезка Ъ, отсекаемого прямой на оси ординат, равна 0,098.

Количественные значения коэффициентов К и Ь, характеризующие прямую линию",: были рассчитаны также по методу наименьших квадратов по следующим формулам:

NKX;, - (5X;) +Y; (QY;) (2 Х;) -(QX;) (

1 где Х вЂ” концентрация изосалипурпо1 энда;

N — число опытов;

Y« — отношение площадей пиков ! изосалипурпозида и салициловой кислоты при данной концентрации изосалипурпозида.

Используя данные табл. 4, вычислили К и Ъ: К = 0,058; Ь =.0,098.

Используемый образец фламина (20 мг) растворяют в 20 мл системы I.

К 1 мл этого раствора добавляют 1 мл

0,008Х-ного раствора салициловой кислоты. Пробу полученной смеси вводят в колонку хроматографа и проводят пятикратный анализ в ступенчатом режиме: система I — - до 13-й минуты, система II — с 13-й по 30-ю минуту при скорости потока 1 мл/мин. Hs хроматограмм находят отношение площадей пиков изосалипурпозида и салициловой кислоты (Я /S ) и по общей формуле определяют процентное содержание иэосалипурпозида .во фламине.. Полученные результаты приведены в табл. 5.

Содержание изосалипурпозида в данном образце фламина 8,63+0,24Х.Точность способа-прототипа «+3,5-6Ж.

При проведении опытов были использованы готовые колонки, упакованные сорбентом марки Nucleosil C,s (силикагель с привитыми октадецилсилановыми группами) с размером частиц

10 мкм.

Оптимизация процесса хроматографического разделения фламина

Элюентная система

Наблюдаемый результат разделения компонентов

Выводы

В области гликозидов б пиков с большими временами удерживания в интервале 30 мин.: агликоны не элюируются

Вода - ацетонитрил — уксусная кислота — тетрагидфофуран

70,5:19:4:295

7i 5:20:5:3,5

Четкое деление гликозидов в Выбрана в качест. интервале 15 мин, агликоны ве системы Х не элюируются, 72 5:21:б:495

В гликозидной части б пиков„ мало различающихся по временам удерживания, агликоны не элюируются

Вода - ацетонитрил — уксусная кислота

11:б:О

12:7:1

Агликоны не элюируются

В области агликонов разделе-= Выбрана в качестние на пять компонентов . ве системы II а

Аглнконы образуют ч пика, близкие по временам удержания.

13 8 2

Для изготовления хроматографических систем использовали ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х.ч.

ТУ-6-09-06"1092-82; тетрагидрофуран, ча 9 ТУ 6-09-3686-77, который выдерживали над сухой щелочью и перегоняли при атмосферном давлении; уксус:. ную кислоту, х.ч., ГОСТ 61-75, которую вымораживали и перегоняли при 1Î атмосферном давлении.

Идентификация пиков отдельных компонентов фламина была проведена путем сравнения их времен удержания с временами удерживания стандартных индивидуальных образцов9 а также по увеличению площадей пика компонента во фламине при добавлении к нему стандартного образца.

Формула изобретения

Способ количественного определения компонентов фламина путем .хроматографирования его раствора, спектрофотометрического анализа компонентов с последующим расчетом по калибровочному графику, о т л и ч а ю,шийся тем, что, с. целью повышения точности определения за счет увеличения степени разделения компонентов, в исследуемый раствор дополнительно вводят внутренний стандарт — салициловую кислоту и хроматаграфическое разделе-ние ведут последовательно в двух системах растворителей: I вода — ацето нитрил — уксусная кислота — тетрагидрофуран 71,5:20:5:3,59 II вода - ацстонитрил — уксусная кислота 12:7:1.

133407?

Таблица 2

Расчет содержания кемпферол-3-глюкозида во фламине

Проба

Отношение площадей

Процентное содержание кемпферол-3глюкозида

Площадь пика кемпферол- салици3-глюкозида ловой кислоты

3,81

3,21

3,36

3,63

3,41

Таблица 3

Данные хроматографического анализа изосалипурпозида для построения калибровочного графика

Среднее отношение площадей пиков изоизосалипурпозида и салициловой. кислоиз о.с

Концентрация иэосалипурпозида, мкг/мл (Х) 20

1,23

2,39

3,72

4,77

5,98

100

Т а б л и ц а 4

Предварительные расчеты, необходимые для вычисления козффициентов К и Ъ по методу наименьших квадратов

) 1 (Т

Опыт Х Y Х XY

1,23

400

2,39

1600

3600

3,72

4,77

6400

381,60

587,00

100.

5,87

10000

17,98

300

22000

1312, 00

1 720916 189059

2 697957 217355 3 724757 215636

4 734176 202032

5 683482 200460

14,78

12,52

13,08

14,10

13,27

24,60

95,60

223,20

1334077

Таблица 5

Процентное содержание изосалипурпозида во фламине

Проба

2,48

8,21

?,64

8,77

?,69

8,94

2,66

?,54

8,83

8,42

Составитель А. Агуреев

Техред Л.Сердюкова

Корректор А. Тяско

Редактор А. Orap

Заказ 3958/42

Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Отношение площадей иков изосалипурпозида и салициЛовой кислоты (s„,/s„) Процентное содержание изосалипурпозида