Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2-го серотипа, используемый для специфической лабораторной диагностики

 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является получение нового штамма вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2-го серотипа.Штамм УФА CG-1820 вируса ГЛПС получают путем последовательного пассирования суспензии легочной ткани рыжей - полевки, отловленной в природном очаге ГЛПС в г. Уфе, rta культуре клеток VERQ-E6. . Штамм-хранится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером ГКВ-706 и характеризуется следукщими признаками. При электронно-микро скопическом изучении инфицированных клеток УЕЕО- Еб выявляются частицы округлой формы с диаметром около 10 нм, окруженные липопротеиновой оболочкой. Вирус размножается в культуре клеток VERO-E6 при 37°С, рН - 7,2-7,8, множественность заражения составляет не менее 0,1 вирусной частицы на клетку, максимальный титр вируса обнаруживается на 12-14 день заражения и составляет 3,0-6,0 log ИДу,,, . В крови зараженных животных с 10 дня после заражения накапливаются специфические антитела к вирусу ГЛПС. Для выявления специфических антител к вирусу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стёкла с антисеном вируса УФА CG-18 0. Основанием для постановки лабораторного диагноза служат результаты метода флуоресцирующих антител, указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках. 1 табл. Ф (У) с оэ со СП ел |ib

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1319554

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

:чл " ; 1ЯЩЦ

H ABTOPCROMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

М

laaL

CO

Яд

СЛ

4:1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

„(46) 23. 07. 90, Бюл. N"- 27 (21) 3928803/28-13 (22) 10.07,85 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (72) В.Н. Башкирцев, Е.А. Ткаченко, .Т.К. Дзагурова, Е,В. Рыльцева, С.Г. Дроздов и A.Ã. Степаненко (53) 576.858.25(088.8) (56) Н.W. Lee, Р.W. Lee, К.М. Johuaon 1978. Isolation of etiologie

agent of korean hemorrhagic feber. ,7. Infect, 0is. 137:298-308. (54) ШТАММ ВИРУСА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ

ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЬ!М СИНДРОМОМ 2-ГО

СЕРОТИПА, ИС!!ОЛЬЗУЕИЫЙ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ (57) Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является получение нового штамма вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2-ro серотипа.Штамм УФА

CG-1820 вируса ГЛПС получают путем последовательного пассирования суспензии легочной ткани рыжей. полевки, отловленной в природном очаге ГЛПС в г. Уфе, иа культуре клеток Vего-E6. (5))5 С 12 N 7/00, А 61 К 39/12 //

// (С 12 N 7/00, С 12 R 1:91) Штамм хранится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером

ГКВ-706 и характеризуется следующими признаками. При электронно-микро скопическом изучении инфицированных клеток Vего-Е6 выявляются частицы окI руглой формы с диаметром около 10 нм, окруженные липопротеиновой оболочкой.

Вирус размножается в культуре клеток

VEk0-Е6 при 37 С, рН вЂ” 7,?-7,8, множественность заражения составляет не менее 0,1 вирусной частицы на клетку, максимальный титр вируса обнаруживается на 12-14 день заражения и составляет 5,0-6,0 log ИД, „ . а

Ф

В крови зараженных животных с 10 дня после заражения накапливаются специ-. фические антитела к вирусу ГЛПС. Для выявления специфических антител к ви- ( русу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антисеном вируса УФА

CG-18)0. Основанием для постановки лабораторного диагноза служат результаты метода флуоресцирующих антител, указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках. 1 табл.

Изобретение относится к вирусоло- слоя. Затем во флаконы добавляют гни и может быть использовано для ла- 1 мп свежей питательной среды с 10Х бораторной диагностики геморрагичес- нормальной телячьей сыворотки.(НТС) кой лихорадки с почечным синдромом. (г проводят в этом объеме с гпендироЦелью изобретения. является получе- 5 ванне клеток. Взвесь инфицированных ние нового штамма вируса геморрагн- клеток в объеме 0,2 мл смешивают с . ческой лихорадки с почечным синдро- . Равным объемом суспензин свежих нормом 2-ого серотипа ° мальных клеток ЧЕКО-Е6, обеспечивая

Данный штамм получают следующим необходимую концентрацию клеточной образом. fQ суспензии (50000-60000 клеток в 1 мл) Легочную ткань самца рыжей полев- добавлением среды Игла 2-МЕИ с ки возраста 11-12 месяцев трижды от- НТС. Через 2 сут. инкубирования при мывают в физиологическом растворе, 37 С во флаконах заменяют среду poc- о (0,85Х ИаС1), содержащем антибиотики Ta Ha среду поддержания роста клеток пенициллин, стрептомицин, канамицин 15 и продолжают инкубировать клетки при о в концентрации 500 ЕД/мл, 250 мкг/мл 37 С в течение еще 10 дней. Субкульи 500 Ед/мл соответственно) ° Затем тивирование инфицированных клеток ткань помещают в стерильную ступку VER0-Е6 проводят в дальнейшем по .анан тщательно растирают в присутствии .логичной методике с 12-дневным интернебольшого количества стерильного 20 валом. песка. Добавляют физиологический ра- Начиная со 2 пассажа часть инфициствор с 2Х нормальной телячьей сыво- Рованных клеток наносят на предметротки из такого расчета, чтобы полу- ные стекла и исследуют их на.присутчить 10Х-ную суспензию легочной тка- ствие специфического флуоресцирующени (на 1 г легких добавляют соответ- го антигена вируса геморрагической ственно 1,0 мл физиологического раст- лихорадки с почечным синдромом (JIIIC). вора). Легочяую суспензию отсасывают "а уровие 2-го пассажа специфическое стерильной пипеткой и переносят в ин- свечение ачтигена вируса JEIC обнарусулиновый флакон, который помещают жнвается лишь в отдельных единичных

B низкоскоростную центрифугу. После,.30 клетках в поле эРениЯ. ОтмечаетсЯ пентрифугирования прн 6000 об./мин в .цитоплазматическаЯ локализациЯ антитечение 30 мин надосадочную жидкость гена вируса ГЛПС, преимущественно в осторожно извлекают и используют для перинуклеарной зоне инфицированных зара>кения .клеточной культуры. клеток, для которого характерно неждля заражения используют клетки 35 ное желто-зеленое мелкозернистое свеVERQ-Е6, которые выращивают в 50 мл ..чение. По мере адаптации вируса в флаконах до образования полного моно- пассажах наблюдается образование бослоя. Осветленную 1ОХ-ную суспенэию лее крупных гранул, равномерно заполлегочной ткани вносят в 4 флакона по няющих всю цнтоплазму клеток. Специ0,2 мл в каждьй. После контакта ино- 40 фическое свечение определяется как кулята с клетками при 37 С в течение, ярко-зеленая люминесценция на фоне

40 мин. MoHocJIOH клеток дважды отмы- непораженных клеток кирпичного цвевают средой Игла и во флаконы добав- та. Количество антигенположительных " ляют среду для поддержания роста кле- клеток заметно возрастает от пассаток (среда Игла 2-МЕИ с 2Х нормаль- 45 жа к пассажу и составляет 90-100Х к ной телячьей сыворотки), Инкубирова- 5-6 пассажу. Цитопатического эффекта с

1 ние инфицированных культур клеток .в инфицированных культурах не наблюпроводят в термостате при 37 С, дается. На уровне 6 пассажа суспенЧерез 1 2 дней с момента инокуля- -зии инфицированных клеток разливают .ции клеток культуральную жидкость gp no 0,5 мл во флаконы и хранят при сливают, клеточный монослой дважды 60 С. В дальнейшем эти суспензия отмывают раствором Хенкса и обрабаты- используют в качестве посевного вивают последовательно 0,25Х-ным раст- руса и обозначают как штамм УФА.CGвором трипсина (2 мл на флакон) и . 1820, .0,02Х-нйгм раствором версена (? мл, 55 Штамм УФА CG-1820 хранится в Гона флакон) по 2 мин кая;цыгг. После сударственной коллекции вирусов Ин-. удаления версена флаконы. с клетками ститута вирусологии им. Д.И. Ивановинкубируют в термостате при 37 С до ского AMH под номером ГКВ-706 и хапоявления признаков разрыхления моно- рактериэуется следующими признаками, 13195

Морфологические признаки.

Прп электронно-микроскопическом изучении клеток VERÎ-ЕЬ> инфицированных штаммом УФА CG-1820 вируса ГЛПС, выявляются частицы округлой или овальной формы с диаметром в среднем

100 нм, окруженные хорошо контурирующейся липопротеиновой оболочкой.Иор,фология частиц сходна с морфологией

1вирусов семейства Буньявириде. Вместе с тем очевидно, что некоторые особенности морфологии и морфогенеза свидетельствуют об его определенн и таксономической обособлениости от вирусбв известных четырех родов это5 го семейства.

Биологические признаки, Оптимальная множественность заражения клеток Vего-ЕЬ штаммом УФА

СС-1820 составляет не менее О, 1 вирусной частицы на клетку. Оптималь,ной температурой размножения штамма

,в культуре клеток Vего-E6 является

t + 37 С. Вирус стабилен в интервале, рН от 7,2 до 7,8. Иаксимальный титр вируса. при заражении культуры клеток VERÎ-ЕЬ составляет 5,0-6,0

log ИД „„; сроки максимального накопления ",,луоресцирующего антигена вируса ГЛПС составляют 12-14 дней.

Инфекционные признаки.

При введении штамма УФА СС-1820 вируса ГЛПС лабораторным животным (взрослые белые мыши, белые крысы, морские свинки, кролики) клинических проявлений заболевания и их гибели не наблюдается в течение всего срока наблюдения за животнымл (до 3-х месяцев с момента инокулирования вируса). Вместе с тем, начиная с 10 дня после заражения, в их крови обнаруживается накопление специфических антител к вирусу ГЛПС. Оптимум накопления антител определяется к

25-30 дню с момента их заражения. Таким образом, экспериментальные животные могут быть использованы для иммунизации и получения иммунных антиГЛПС сывороток, но не для пассирования живого вируса.

Полная,инактивация инфекционной активности штамма УФА CG-.1820 .вируса

ГЛПС происходит при его нагревании при 60 С в течение 30 мин н при обработке ультрафиолетовым облучением

° (бактерицидные лампы) в течение 2 ч.

Антигенная активность в первом случае снижается в 4 раза, а во втором случае остается без изменения.

54 . Д

Хранение вирусного штамма осуществляется в виде суспензин инфицированных клеток 17ЕРО-Еб с добавлением

5Х НТС при температуре -60"С, При таком режиме хранения вирусный штамм не теряет своей инфекционной и антигенной активности в течение 1 года (срок наблюдения).

Использование штамма УФА CG-1820 для специфической лабораторной диагностики. иллюстрируется следующим примером.

Для заражения вирусом используют суспензию клеток Uего-ЕЬ. После внесения вируссодержащей суспензии во флаконы с взвесью клеток их помещают в термостат при 37 С. Культивирование вируса ГЛПС в клетках осуществляют в. течение 12-14 суток.

На 12-14 сутки с начала инфицирования клеток Uего-Е6 вирусом ГЛПС, монослой клеток последовательно обрабатывают раствором трипсина и версена, после чего проводят суспендирование инфицированных клеток в неболь- шом количестве физиологического раствора. Конечная концентрация клеток должна состалять 300-400 тысяч в 1,0 мл.

Аналогичным образом готовят суспензию нормальных неинфицированных клеток Vего-E6. Суспензии инфицированных и нормальных клеток сме ииэа ют в равных объемах и раскапывают на предметные стекла по 3-5 мкл на каждый мазок. После полного высыхания суспензий препараты фиксируют в охлажденном ацетоне в течение 15- —,.

20 мин и затем обрабатывают ультрафиолетовым облучением для инактивации инфекционной активности вируса, Приготовленные таким образом антигенные препараты до использования хранят при — 60 С.

Для выявления специфических антител к вирусу ГЛПС исследуемые сыворотки крови больных людей наносят на предметные стекла с антигеном вируса ГЛПС. Сыворотки обследуют методом флуоресцирующих антител в разведениях 1:!6 и выше ° Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают при 37 С .в течение 30 мин, и затем стекла трехкратно промывают

0,01 М фосфатным буферным раствором и сушат при комнатной температуре.

На препараты наносят люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека в рабочем разведении, которое on- .

1319554.

Выявление антител к вирусу ГЛПС в сыворотках крови больных с помощью вирусного антигена штамма УФА CG1820 2-oro серотипа методом МФА ределяют в предварительном опыте. В качестве контрастера используют раст.вор Голубого Эванса в конечной концентрации 1: 10 000. Препараты вновь инкубируют во влажной камере при тем- 5 пературе 37 С в течение 30 мнн, затем промывают их, высушивают и регистрируют е помощью люминесцентного микроскопа.

Для вируса ГЛПС характерналокали- 10 эация флуоресцирующего антигена с четкой гранулярной структурой в цитоллаэме клеток. Яркое изумрудно-зеленое гранулярное свечение антигена вируса ГЛПС просматривают на фоне кир- 15 пичного окрашивания структуры нормальных неинфицированных клеток..Такой же .кирпично-красный фон отмечают и на мазках с нормальной сывороткой, используемой в качестве контроля. 20

Титром сыворотки считают ее наивысшее разведение, способное еще выявлять специфический антиген вируса

ГЛПС. Для постановки серологического

1диагноза обследуют две сыворотки кро- 5 . ви.от каждого больного. Первую сыворотку получают тотчас же после выявления заболевания, а вторую — через °

3-5 дней после забора первой. Основанием для постановки лабораторного диагноза.служат результаты полученные с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА), указывающие на четырехкратное или более значительное нарастание титров специфических антител 35 к вирусу ГЛПС во вторых сыворотках.

Результаты МФА представлены в таблице.

Титры сыворотки в МФА с антигеном штамма УФА

CG-1820

Сыворотки День бокрови боль- лезни ных ГЛПС

1837 (УФА) 1:512

1:2048

1: 16384

58

1842 (УФА) 1: 1024

1: 8192

1865 (Устинов) 1:256

1: 1024

1;4096

974 (Владивосток) 1:32

1: 128

1022 (Хабаровск) (16.ф о р м у л а и з обретения

1: 16

1:64

Штамм вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом 2- го серотипа, ГКВ Р 706 (Государственная коллекция вирусов Института виру- 45 700047 (К, » сологии им. Д.И.Ивановского АИН СССР),,рея) ,используемый для специфической лабораторной диагностики.

1:16

Составитель И. Серова

Редактор М. Кузнецова Техред Л.Олийнык Корректор М.Демчик

Заказ 2489 Тираж 494 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4.