Способ выделения сайт-специфической эндонуклеазы cla i
Изобретение относится к биотехнологии , а именно к получению сайтспецифических эндонуклеаз, предназначенных для создания рекомбинантных молекул ДНК, анализа первичной структуру ДНК, создания банков генов. Цель изобретения - увеличение выхода сайт-специфической эндонуклеазы Cla I и повышение степени очистки ее от примесей. Для этого готовят носитель с иммобилизованным цибарконовым синим F3GA. Затем выделяют эндонуклеазу Cla I. Бесклеточный экстракт С. latum G, содержащий зндонуклеазу Cla I о( наносят на колонку, содержащую носитель с иммобилизованным красителем F3GA. Колонку промывают 10 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М NaCl до нулевого оптического поглощения при 280 им. Затем элюируют белки. Эндонуклеаза Cla I элюирует при. концентрации NaCl 0,5-0,8 М. Фракции, содержащие ферг мент, объединяют, диализуют 6-10 ч против буфера, содержащего 50% глицерин , хранят при -20°С. Б полученном препарате определяют активность Cla I содержание белка и нуклеиновых кислот . 1 табл. оо о С5 IsD
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (51)4 С 12 N 9 00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3839406/28-14 (22) 02.01.85 (46) 30.01;88. Бюл. У 4 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) В.М.Крамаров, В.В.Мочалов и В.В.Смолянинов (53) 575.113(088.8) (56) Mayer H. et al., 1981, Nucl
Acids Res, Ч. 9, У 19, р. 4833-4845. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ Cla I (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению сайтспецифических эндонуклеаз, предназначенных для создания рекомбинантных молекул ДНК, анализа первичной структуры ДНК, создания банков генов.
Цель изобретения — увеличение выхода сайт-специфической эндонуклеазы
„„SU„„1306127 А 1
Cla I и повышение степени очистки ее от примесей. Для этого готовят носитель с иммобилизованным цибарконовым синим F3GA. Затем выделяют эндонуклеазу С1а Х. Бесклеточный экстракт С. 1аСюп 6, содержащий зндонуклеазу Cla I Ы наносят на колонку, содержащую носитель с иммобилизованным красителем РЗСА. Колонку промывают 10 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М ИаС1 до нулевого оптического поглощения при 280 нм.
Затем элюируют белки. Эндонуклеаза
Cla I элюирует при концентрации NaCl
0,5-0,8 M. Фракции, содержащие фер " мент, объединяют, диализуют 6-10 ч против буфера, содержащего 50Х глице рин, хранят при -20 С. В полученном препарате определяют активность Cla I, содержание белка и нуклеиновых кислот. 1 табл.
1306127 при -20 С. B полученном препарате определяют активность СХа Х, содержание белка и нуклеиновых кислот.
Пример. Определение оптимального содержания иммобилиэованного красителя.
Бесклеточный экстракт, содержащий Cla I, наносят на колонки с различным содержанием красителя F3GA и проводят выделение фермента. Зависимость выхода Cla I (на 1 г биомассы) от количества иммобилизованного красителя дана в таблице.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению сайт-специфических зндонуклеаз, предназначенных для создания реком5 бинантных молекул ДНК, анализа первичной структуры ДНК, создания банков генов.
Целью изобретения является увеличение выхода сайт-специфической эндонуклеазы Cla Х и повьппение степени очистки ее от примесей.
Способ осуществляют следующим образом.
Приготовление носителя с иммобилизованным цибакроновым синим УЗЫ.
20 мл сефарозы CL 4Â суспендируют в
30 мл Н О, добавляют 110 мг красителя УЗЛА, затем раствор 4 М ИаСХ до конечной концентрации 0,4 М, объем при этом доводят до 45 мл, После
20 мин механического перемешивания смеси добавляют 0,2 мл 5 М NaOH u инкубируют при 62 С. Проверяют количество иммобилизованного красителя по уменьшению оптического поглощения надосадочной жидкости при 610 нм, После завершения реакции несвязавшийся краситель отмывают на стеклянном фильтре дистиллированной водой до исчезновения синей окраски в промывных водах.
Выделение эндонуклеазы Cla I.
Бесклеточный экстракт С. Хat.ëï G, содержащий эндонуклеазу СХа Х, Ь, наносят на колонку, содержащую носитель 35 с иммобилизованным красителем УЗЛА.
Колонку промывают 10 мМ калийфосфатным буфером, содержащим 0,1 М NaC1 до нулевого оптического поглощения при 280 нм и затем элюируют белки лид0 нейным градиентом 0,1-1 N NaCI в
1О мМ калий-фосфатном буфере. Эндонуклеаза Cla Х элюирует в области концентрацией NaC1 0,5-0,8 М,Фракции, содержащие фермент, объединяют, диализируют 6-10 ч против буфера, содержащего 50Х глицерина, и хранят
Количество
Активностьр ед
Молярность, при которой элюируется фермент красителя на 1 мл носителя„ мкмоль
0,9 5000
1,6 5000
2,5 2000
Более 3 500
0,5-0,7
0,5-0,8
0,8-1,5
Более 1,5
Формула изобретения
Способ выделения сайт-специфической эндонуклеазы Cla I, включающий получение бесклеточного экстракта
С. lat, L„ õpîìaòîãðàôèþ его с последующей элюцией целевого продукта раствором хлористого натрия, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения степени чистоты и уцельной активности делевого продукта, хроматографию экстракта осуществляют на сорбенте с иммобилизованным лигандом цибакроновым синим
РЗСА при содержании лиганда 0,92,0 мкмоль/мл сорбента, а элюцию проводят в градиенте концентрации хлористого натрия.
Составитель А,Макаров
ТехРед М.Ходанич Корректор П. Патай
Редактор А.Купрякова
Заказ 739
Тираж 520 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, .Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
