Способ определения гистидина
№ 131962
Класс 421, Зо.
421> 308.>г
1г1 1г, l
" ., . - 1 г,1 6 и гг г ссср
l г ° ° >, uл р,>, 1> ) Т;" >
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ABTGPCHOM> СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Подписная группа № 178
А. П. Сафронов
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕИИЯ ГИСТИДИНА
Заявлено 30 декабря 1959 г. за № 649156/23 в Комитет по делам изобретений и открытий при Совете >>1иниетров СССР
Опубликовано в «Бюллетене изобретений» ¹ 18 за 1960 т.
Методы открытия и определения микроколичеств гистидина представляют большой интерес для врачей, биохимиков и физиологов, изучающих обменные процессы растительных и жизотных организмов, в которых участвует данная аминокислота. Важность более полного изучения ее функций видна хотя бы из того, что она генетически близка к биогенному аминогистамину. Последний, по-видимому, играет весьма существенную роль в развитии ряда тяжелых заболеваний человека и кивотных и, в частности, болезни, вызванной действием ионизирующей радиации.
Предлагаемый сгпособ определения гистидина бромированием и конденсацией е"о, заключается в том, что для повышения чувствительности и избирательности способа, продукт бромирования конденсируют с циктическими соединениями, содержащими группы СНз — СО, например, с димедоном или фенилметилпиразолоном. Образозавшийся нерастворимый в воде на холоду краситель экстрагируют органическим расворителем, например смесью этил- и изоамилацетатов и определяют оптическую плотность раствора красителя, пропорциональную содержанию гистидина в исходном ооразце.
Наиболее существенными критериями аналитического мегода являются предел его чувствительности и степень изоирательности. Опыты позволяют утверждать, что предложенная реакция более чувствительна, чем все известные до сих пор цветные тесты на гистидин. Так. при анализе чистых водных растворов аминокислоты окраска в органическом растворителе появлялась при 2 — 3 микрограммах:кислоты в 5,3 лл водной фазы, т. е. при разведении около 1: 2.500.000.
Изоирательность реакции проверена отдельными опытами с биогенными или близкими к ним органическими соединениями. Ни одно из
100 проверенных веществ не показывало идентичной цветной реакции.
Димедоновая реакция была использована для определения гистидина в сложных для анализа объектах, как, например, в моче Предлагаемый спосоо ускоряет проведение анализа данной аминокислоты и улучшает при этом избирательность и чувствительность .реакций. Он № 1319б2
Предм ет изобр етения
Способ определения гистидина при помощи его бромирования и конденсации, о тл и ча ю Ill, и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и избирательности способа, продукт бромирования конденсируют с циклическими соединениями, содержащими группы CH2 — СО, например, с димедоном или фенилметилпиразолоном, образовавшийся нерастзсримый в воде на холоду краситель экстрагируют органическим растворителем, например смесью этил- и изоамилацетатов, и определяют оптическую плотность раствора красителя, пропорциональную содержанию IHcTHäè rà в образце.
Редактор С, А..Барсуков Техред А, А. Камышникова Корректор Л. Е. Чекунова
Формат бум. 70Х!08 /s6 Объем 0,17 п. л.
Тираж 800 Цена 25 коп.; с !.1-61 г. — 3 коп.
ЦБТИ при Комитете по делам изобретений и открытий прн Совете Министров СССР
Москва, Центр, М. Черкасский пер., д. 2/6
Поди. к печ. 15.Х1-60 г
Зак. 9479
Типографии ЦБТИ Комитета по делам изобретений н открытий при Совете Министров CC(.Р, Москва, Петровка, 14.
12 доступнее многих других способов и не требует уникальных или дорогостоящих реактивов. Расход реактивов на анализ неоольшой, что имеет важное значение при серийных î lbITBx.
П р им е р. Определение гистидина в биогенных субстратах.
A. Методика определения гистидина и получение данных для построения калисровочного графика.
Свежеприготовленные водные растворы, содержащие в 4 мл от 2 до 12 мкг гистидина, при температуре около 16 бромируют смесью, состоящей из 0,1 мл раствора КВг (24 г КВг в 100 мл воды), 0,1 мл раствора КВгОз (4 г КВ;Оа в 100 мл воды) и 0,5 мл 5 и НзРО4. Через !
0 мин к реакционной смеси прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора
HCOONa. 2Н20 и 1,0 мл насыщенного на холоду и профильтрованного раствора димедона (демитилдигидрорезорцина). Полученную реакционную смесь паггевают 10 мин при 90 и быстро охлаждают водой до комнатной температуры. Образовавшийся г крашенный продукт извлекают 5 мл смеси равных объемов этилацетата и изоамилацетата и через
10 мин определяют оптическую плотность полученного экстракта.
При содержании в 4 мл исходного раствора 2,5; 5,0; 7,4; 9,8 и
12,4 мкг гистидина оптические .плотности экстракта, полученного описанным способом, при измерении на фотоэлектроколориметре ФЭК-Н-54, составляют соответственно: 0,052; 0,114; 0,184; 0,229 и 0,264, т. е. нарастание оптических плотностей практически пропорционально увеличению концентрации гистидина в исходных растворах и соответствующийкалибрсвочный .график почти приближается к прямой.
Б. По списанной методике определяют содержание гистидипа в обычной моче а человека и в той же моче b, в которую дополнительно введено известное количество гистидина. а b
Взято неразбавленной мочи (мл) и05 0!й
Объем пробы после разбавления водой (мл) 4,0 4,0
Введено в пробу чистого гистидина (мкг) — 3,1
Найдено гистидина в моче (мкг) 6 2 9,1
Найдено в моче введенного гистидина (мкг) — 2,9
% введеннoro гистидина, определенный по анализу — 93,5
Результаты аналитических определений подтверждают правильность описанной методики определения гистидина.
