Способ подготовки мозговой ткани к исследованию секреции медиаторов

 

Изобретение относится к медицине , в частности к способам исследования нервной системы, преимущественно процессов секреции биологически активных соединений. Цель изобретения - ускорение и повышение физиологичности способа путем исключения приемов подготовки, травмирующих ткань. Инкубацию и промывку срезов проводят способом перфузии при рН 7,20-7,35. Отмывание осуществляют путем 10-15-кратного переноса в свежую среду инкубации, содержащую NaCl, КС1, CaClj, MgSO., глюкозу, аскорбиновую кислоту, NaKCOj при насыщении карбогеном. Инкубационную среду сохрйняют для количественного исследования - спонтанная секреция. 4 ил, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.SU„„72250

А1 (5g 4 С 01 Х 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТАЯ (21) 391 51 4 2/28-14 (22) 25.06.85 (46) 23.11.86. Бюл. 11- 43 (71) Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии АН СССР (72) А.С. Базян (53) 616-003,725(088.8) (56) Авакян О.М. Симпатоадреналовая система. -Л.: Наука, 1977, с.56-113. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ МОЗГОВОЙ ТКАНИ К ИССЛЕДОВАНИ10 СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРОВ, (57) Изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования нервной системы, преимущественно процессов секреции биологически актинных соединений. Цель изобретения — ускорение и повьппение физиологичности способа путем исключения приемов подготовки, травмирующих ткань. Иикубацию и промывку срезон проводят способом перфузии при рН

7,20-7,35. Отмывание осуществляют путем 10-15-кратного переноса н свежую среду инкубации, содержащую NaC1

КС1, СаС1, MgS0, глюкозу, аскорбиновую кислоту, NaHCO> при насыщении карбогеном. Инкубационную среду сохраняют для количественного исследования — спонтанная секреция, 4 ил, 2 табл.

1272250

f0 подвесного штатива-встряхивателя 18, 15 имеющего восемь гнезд диаметром 20 мм и одно гнездо диаметром 50 мм для общего объема, в котором одновременно инкубируют четыре образца ткани, заключенные в держатели, а также из

20 пробирок 19 диаметром 15-20 мм и высотой 40 г:м для инкубации сред, в которые помещают держатели 20 образцов.

Блок термостатирования (фиг.3}, 2S предназначенный для термостатирования образцов ткани, инкубационных сред, состоит из двух термостатов 1в для гемокоагуляции — ТПС, В середине ванны 21 первого термостата подвеской 22 прикрепляют свободно качающийся штатив-встряхиватель 23 длиной

155 мм, шириной 55 мм и высотой .

40 мм, Подвеску 22 прикрепляют нижним концом к нижней пластине штатива 23, При этом длина подвески составляет

35 80 мм, Справа, на корпусе термостата, прикрепляют мотор 21 с шатуном 25 для встряхивания штатива. Мотор прикрепляют к корпусу термостата кронштейном 26, к которому и крепят при помощи длинного болта и гаек подвеску

22. Вторую подвеску штатива с противоположной стороны прикрепляют к корпусу ванны также при помощи кронштейна, болта и гаек. Блок содержит

45 также. контактный 27 и измерительный

28 термометры и мотор 29 для перемешивания жидкости в ванне, Автоматическую подачу инкубационных сред осуществляют двумя автоматическими дозаторами 7а и 7б, которые предназначены для подачи инкубационных сред фиксированными объемами в инкубационные пробирки 19.

Делитель карбогена (фиг.4) предS5 назначен для равномерного распределения карбогена во все необходимые узлы и блоки, Ои состоит йз сосуда

30, наполненного водой для увлажнеИзобретение относится к медицине, в частности к способам исследования нервной системы, преимущественно процессов секреции биологически активных соединений, S

Цель изобретения — ускорение и повышение физиологичности способа эа счет устранения приемов подготовки, травмирующих ткань, инкубацию и отмывание проводят при рН 7,20-7,35, причем отмывание осуществляют путем

10-15-кратного переноса в свежую среду инкубации.

Иа фиг.1 показана функциональная схема устройства; на фиг,2 — схема держателей срезов; на фиг. 3 — блок термостатирования; на фиг,4 — делитель карбогена, Функциональная схема содержит водяные термостаты 1 для исследуемых образцов ткани и основных инкубационных сред, держатели 3 срезов, подключенные силиконовыми трубками 3, к выходам делителя 4 карбогена, объемы 5а и 5б основных инкубационных сред, подключенные силиконовыми трубками 6 к выходу делителя карбогена, автоматические дозаторы 7а и 7б подключенные силиконовыми трубками 8 к объемам основных инкубационных сред, и источник 9 карбогена, подключенный силиконовой трубкой 10 к делителю карбогена ° Трубки, подающие карбоген (фиг.1), представлены сдвоенными тонкими линиями, а инкубационные средыодинарной жирной.

Держатели срезов мозга (фиг,2) предназначены для быстрого переноса образцов исследуемой ткани из одной инкубационной среды в другую.

При помощи алмазной пилки в нижt ней части полой стеклянной трубки диаметром 10 мм и длиной 70 мм выпиливают под струей воды два окна шириной

4-5 мм и длиной 7-8 мм для циркуляции среды 11 инкубации. На 3-4 мм выше окон выпиливают четыре. отверстия

12 диаметром 1-2 мм для циркуляции карбогена. На верхней части стеклянной трубки выпиливают отверстие 13 для выхода излишка карбогена. Окна покрывают нейлоновой сеткой 14 одноразового пользования, которую прикрепляют к корпусу держателя силиконовым кольцом 15 ° Силиконовые трубки от делителя 16 карбогена фиксируют в держателе при помощи резиновой пробки 17 на такой высоте, чтобы они не погружались в инкубационную среду при переносе туда держателя. Так как среда предварительно насыщена карбогеном, то карбоген, поступающий в держатель 2 через четыре отверстия в корпусе, полностью вытесняет воздух с поверхности среды инкубации и препятствует обмену карбогена, растворенного в среде с воздухом. Такое поддержание насыщенности среды позволяет использовать одновременно несколько держателей, Полный блок держателей образцов (фиг.2) состоит из з !272250 4 ния карбогена, тройника 31, первый торяют 5 — 8 раз (10- 6 мин) . Дальвыход которого связан с объемом 5а инкубационной среды, третий выход— выполняют при добавлении в инкубацис объемом 56 с е р ды деполяризации, онную среду определенной концентрачетверника 32, вход которого связан 5 ции фармакологического агента ° Приес вторым выходом тройника 31, а каж- мы Г и Д выполняют также при наличии дыи из четырех выходов связан с со- в средах той же концентрации агента, ответствующим держателем образцов Возможность практического применеткани, Стрелками указано направление ния изобретения для исследования секдвижения карбогена, Все узлы дели!

О реции и влияние фармакологических теля соединяются между собой силико- агентов на секрецию биологически акновыми трубками. тивных соединений подтверждается слеСпособ осуществляют следующим об- дующими примерами, разом (отдельные приемы осуществле- Пример l Дл

Для инкубации срения обозначены буквами А, Б, В... и !5 зов используют среду В 1; содержащую, т.д.) мМ: Na01 118; КС1 4,8; СаС1 1,3;

Образцы ткани, заключенные в дер- MgSO 2 глюкоза II 1 ЭЛТА 0 004 4 Ф Ф

l Ф 1 t жатели, вносят в один стакан, поме- аскорбиновая кислота 0 11 а фосфат I 1 щенный на штативе термостата и содер- ный буфер рН 7,25 — I; NaHCO — 15; жит среду инкубации, и инкубируют >О рН 7,25 при насыщении карбогеном при 37 С. Все остальные приемы прово- (95_#_ O> + 5X CO ). Для деполяризации дят при той же температуре. При ис- срезов используют среду % 2 отлича1 пользовании меченых биологически ак- ющуюся от среды У 1 только содержативных соединений инкубацию проводят нием NaC1 109,8 мМ КС1 20 мМ в присутствии данного соединения. 25 Четыре тангенциальных среза коры

Промывка. А, За 1 мин до оконча- мозга крыс, толщиной 0,3 мм помещают ния времени совместной инкубации об- в четыре держателя, свободно пронуразцов ткани в тот we штатив помеща- мерованных, при этом номер среза соют пробирки (9, фиг.2), которые за- ответствует номеру держателя, и инполняют 2 мл среды инкубации (объем 30 кубируют 10-15 мин в общем объеме, 5a) автоматическим дозатором 7а.

Б, По истечении времени совмест- Затем в общий объем добавляют )0ной инкубации держатели помещают каж- 20 мкКи DL-Н -норадреналина НА дыи в отдельную пробирку и инкубиру- Amersham, Англия, удельная радиоакют 2 мин. тивность 10-20 Ки/мМ с конечной конВ, Приемы, описанные в А и Б, пов- центрацией 2,5х10 М на 1 мл и инторяют 10-15 раз, Использованную ин- кубируют 10 мин.

Первый этап. После инкубирования

Секреция. Г. За 1 мин до оконча- . каждый держатель со срезом отдельно

1 ния промывки новую серию пробирок эа-40 но параллельно, промывают 30 мин в полняют 1 мл среды инкубации, куда среде !! 1. Промывка описана выше переносят держатели после промывки и (приемь А Б В}, 3 риемы,, }, атем проводят приинк би т 2 мин П с у Рую о ле этого приема емы спонтанной и вызванной секреций инкубационную среду сохраняют для.ко- (Г,Д) с использованием сред Ф 1 и 2. личественного исследования — спонтан 45 Второй этап, После исследования ная секреция. Д, За 1 мин до оконча- секреции срезы промывают восемь раз ния спонтанной секреции новую серию 2 мл среды Ф 1 по 2 мин инкубации. пробирок заполняют 1 мл среды деполя- Затем срезы I u III промывают 7 разризации (объем 56) автоматическим до- 1 мл среды Р 1 по 2 мин инкубапии. затором 76 и переносят туда держате- 50 Срезы ЕТ и IV промывают параллельно ли, инкубируют 2 мин, После этого с I u III при тех we условиях, но в приема среду также сохраняют для ко- среду инкубации автоматической микроличественного ислледования — вызван- пипеткой добавляют 0,05 мл немеченоная секреция, го НА с конечной концентраций !О М

Фармакологический анализ. Для ис- Ы за 14 мин до спонтанной секреции. следования влияния фармакологических Спонтанную и вызванную секреции проагентов на секрецию биологически ак- водят также при концентрации НА тивных соединений приемы А и Б пов- 10 М Третий ретий, четвертый и пятый

127

8 !

28,8 + 4,4

48,4 + 6,9

34,6 +6,2

104,8 + 10,9

1,2 + 0,05 (О, 01

ñ0) 01!

0 7

2,24 +0,13 10 этапы полностью повторяют второй с той лишь разницей, что в этих этапах применяют 10, 10, 10 М немече з -з ного НА соответственно.

Для исследования радиоактивности из проб отбирают по 0,2 мл среды и добанлнют в сцинтилляционный флакон, содержащий 10 мл сцинтиллятора Брея.

Радиоактивность пересчитывают в счетчике фирмы L КВ, Rak Betta и ныражают в распадах в минуту, Определяют интенсивность секреции

/

H - HA S — вызванная секреция Р спонтанная секреция. Для срезов I и III соответственно S, = 2,17;

l)53;, = 1)59; 2)18; S " 1)87;

1,62; S,ð = 1)74+0)2; коэффициент вариации CV = )3,7Х (1-5 — номера этапов), При фармакологическом воздействии экзогенного НА (концентрации указаны в скобках) для срезов II и ЕЧ соответственно S1 1,85; 2,05;

S (!О М) = ) 88; 1,99; Я (10 М)=

=2,53; 2)09; S (IP M) = 1,51; 1)79;

S (10 М) = 1,21; 1,26.

Степень изменения интенсивности секреции в и- м этапе по отношению к

I первому S„= S„ /Б,, Для срезов и III соответственно S, = 0,73; 1;42;

Б = 086; 1,)3; S = 067; 1,3;

Б = 0,95; 1,06. При фармакологичесДля построения кинетической кривой зависимости от концентрации захвата HA.вычисляют чистый эффект воздействия экзогенного НА двумя спосо. бами, Первым способом пересчитывают величину отношения II/I Чистый эффект соответствует концентрации НА составляет 10 M = I 2 — 1 = 0,2;

10 M = 2,24 — 1 = 1,24. Вторым способом приравнивают отношение 1 к

50Х и пересчитывают чистый эффект соответствующей концентрации НА. для отношения II 10 (50/2,28) х х 34,6 - 5/ = 10, 1 х 10 M

2250 а ких воздействиях экзогенного РА

S„ „ (HA) = S,),(НА)/SÄ, для срезов I u соответственно S, (10 M) 1,02;

0,9 ; 8 (10 М) = 1,37; 1,02; (10 8 Г1) 0,8? 0,87; S (IО М)

=0,65; 0,61. Определяют степень фармакологического влияния исследованных концентраций экэогенного HA на

Ь интенсивность секреции Н - НА, !

0 ., = {(, < .,>,1 (

C(10 М) = 1,02/0,73 + 0,97/1,43/2

1,04; C(IO M) = 1,37/0,86 +

+1,02/1.,13/2 = 1,25; C(10 М) = 0,82/0,67 + 0)87/1,3/2 = 0,92;

С(!0 M) = 0,65/0,95 + 0,61/1,06/2

0,63.

Пример 2. Для определения высокоаффинного захвата НА вы21 числяют процентное отношение последующего спонтанного выделения Н

Ъ

НА СВ ) где и = 2-5 к СВ (l 5 — номера этапов), и влияние экзогенного

НА на эти отношения °

30 Табл,1 иллюстрирует влияние экзогенного НА на спонтанное выделение

Н вЂ” НА из срезон коры мозга крыс в инкубационную среду.

45 (50/48,8) х 104,8 — 50 = 58,3. Используя систему. двойных обратных координат, получают линейный график высокоаффинного захвата НА с Км = — 1,5 х 10 М °

П р и м -е р 3. Для сравнения некоторых параметров было поставлено три опыта, в которых промывку срезов проводили способом перфузии.

Табл.2 иллюстрирует результаты осуществления предложенного способа при различных условиях в сравнении с известным.!

272250

Таблица 2

Максимальное количество

Количество

Время иссле дования одного среза

Коэффициент

Спонтанная сек реция в ззвиси мости от степе

Количе ство

Способ парамет ров повьппения точ промывок срезов, исследуемых одновременно в одном ни промывки, мкКи ности способа опыте

Предлагаемый 10

7,25 1223,! 73,4 1,9 4

I ч 30 мин 8

2 ч 10 ìèí 8

7,3 !080,8 59,4 2,!5 4

7,35 980,2 % 57 2,37 4

2 ч 30 мин 8

ИзвестНый

От 3 ч 20 мии I до4ч 10мин

30

Фиг.1

7,4 2323 +272,4 !

Формула изобретения

Способ подготовки мозговой ткани к исследованию секреции медиаторов путем приготовления срезов ткани, инкубации в среде насыщенной карбогеном и отмывания с последующей ре° ъ гистрацией уровня в среде, о т л ич ающий с я тем, что, с целью ускорения и повьщ!ения физиологичности способа за счет устранения приемов подготовки, травмирующих ткань> инкубацию и отмывание проводят при рН

7,20 — 7,35, причем отмывание осуществляют путем !О-!5-кратного переноса в свежую среду инкубации.

1272250

1272250

Составитель А. Агуреев

Техред М.Ходаиич Корректор В, Бутяга

Редактор А. Козориэ

Тирам 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д.4/5

Заказ 6334/44

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4