Способ определения качества половых продуктов у самцов карповых рыб

 

СПОСОБ. ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛОВЫХ ПРОДУКТОВ У САМЦОВ КАРПОЫ)1Х .РЫБ, предусматривающий отбор пробы спермы и последующее ее изучение на функциональную активность, о т W , личающийся тем, что, с целью повышения .точности диагностики степени зрелости и качества сперматозоидов , отобранную пробу подвергают гомогенизации в сахарозном буфере с последующим центрифугированием , обработкой осадка в буфере в присутствии тритона Х-100, трехкратной отмывкой от тритона Х-100 . чистым буфером и экстрагированием .гистонов из осадка ядер в 0,4 н. HCf, после чего гистоны высушивают, подвергают электрофоретическому анализу в полиакриламидном геле, гели окрашивают и проводят элюирование краски из полос субфракций HI, и Ш в 1%-ном додецилсульфате натрия, количество которой измеряют по поглощению при Л 590 на спектрофотомере , а функциональную активность спермы определяют по соотношению -фракций.HI, / HL , при этом к зрелым относят сперматозоиды, у которых соотношение HI,/HJg составляет 3:1. нг, HI,

СОЮЗ СОВЕТСНИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (д1) 4 А О! К 61/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

И2В

Н24 а .б б г д (21) 3706861/28-13 (22) 06.01.84 (46) 30,12;85. Бюл. № 48 (.71) Киевский ордена Ленина государственный университет им Т.Г.Шевченко (72) Л;А.Осадчук, С.Н.Кадура, С.Н.Храпунов, Г. Д.Бердышев, Ю.И.Ильясов и Н.А.Луценко . (53) 639.3.034.2(088.8) (56) Макеева А.П. и Белова Н.В. Про» дуцирование и качество спермы при искусственном разведении растительноядных рыб. — Рыбное хозяйство, 1975, ¹ 7, с. 17-20.

Белова Н.В. Эколого-.физиологические особенности спермы прудовых карповых рыб. Вопросы ихтиологии, т. 23, в. 1, 1983, с. 87-95. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА

ПОЛОВЫХ ПРОДУКТОВ У САМЦОВ .КАРПОВЫХ

;РЫБ, предусматривающий отбор пробы спермы и последующее ее изучение на функциональную активность, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения .точности диагностики степени зрелости и качества сперматозоидов, отобранную пробу подвергают гомогенизации в сахарозном буфере с последующим центрифугированием, обработкой осадка в буфере в присутствии тритона Х-100, трехкратной отмывкой от тритона Х-100 чистым буфером и экстрагированием, гистонов из осадка ядер в 0,4 н, HCf после чего гистоны высушивают, подвергают электрофоретическому анализу в полиакриламидном геле, гели окрашивают и проводят элюирование краски из полос субфракций "1 н HI в 17-ном додецилсульфате натрия, количество которой измеряют по поглощению при = -590 на спектрофотомере, а функциональную активность спермы определяют по соотношению .фРакций )11 / Н1г, пРи зтом к зРелым относят сперматозоиды, у которых соотношение Н1,/ ))1а составляет 3:1.

1200869

Изобретение относится к области биотехники разведения рыб, в частности к способам определения качества половых продуктов у самцов карповых рыб, и может быть использовано в процессах селекции и промьппленного разведения рыб.

Целью изобретения является повышение точности диагностики степени зрелости и качества .сперматозоидов.

На чертеже изображено накопление субфракции гистона HI(HIt) в сперматогенезе белого амура: а — гистоны тимуса теленка (контроль), б — незре" лые семенники, в — зрелые семенники белого амура, г — смерматозоиды, д — печень белого амура (контроль).

Способ позволяет получить объективные показатели спермы рыб и своевременно обеспечить хозяйства рыбопосадочным материалом, что при разведении растительноядных рыб повысит качество продукции на 10-12Х.

Важным преимуществом способа является также то, что анализ основан на определении генетически обусловленного и легко измеряемого признака (накопление конкретного белка), что позволяет проводить. сравнение различных производителей в разные периоды их жизни, т.е. рыб, отличающихся по возрасту, что весьма важно для рыбоводной практики и селекционной работы с рыбами.

Способ осуществляется следующим образом.

Сперматозоиды карповых рыб фиксируют в этиловом спирте. Перед выделением ткань взвешивают. Пробу гомогенизируют в буферном растворе, содержащем 0,25 И сахарозы, 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgC1, 25 мМ КСГ и 25 мИ Ма Я 0 . Гомогенат центрифугируют при 3000 g

15 мин, осадок обрабатывают 0,57.-ным тритоном Х-100 в буферном растворе и затем отмывают от тритона Х-100 трехкратной промывкой ядер в буферном растворе, Затем ядра заливают 0,4 н. HCP и экстрагируют гистоны в течение 4 ч при 4 С. После центрифугирования при 3000 g супернатант заливают трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации

18Х. Гистоны осаждают в течение

24 ч при 4 С, затем осадок собирают центрифугированием, промывают один раз подкисленным (0,25 í. HCf) ацетоном и трижды — чистым ацетоном, после чего гистоны высушивают под вакуумом, "

Электрофорез проводят в !57-ном полиакриламидном геле, содержащем

0,1Х додецилсульфата натрия..Гели окрашивают красителем - 0,17.-ным кумасси голубым R -250 .

Полосы, соответствующие субфрак- .

t0 циям гистона Н1, и HI, вырезают и помещают в 1Е-ный додецилсульфат натрия, Инкубацию полос проводят. в течение 24 ч при 37 С. Затем измеряют поглощение проб с элюироts вавшей краской при 9 =590 на спектрофотометре.

Краситель пропорционально связывается с гистонами поэтому по соотношению концентрации краски, 20 элюировавшей из полос, содержащих субфракции Н1 и HI, можно судить о соотношении концентрации белков в этих субфракциях.

К зрелым сперматозоидам относят

25 те, у которых соотношение H1,/Н1 составляет 3:1.

Использование для осуществления способа 0,4 и. HCE обеспечива30 ет более полную экстракцию гистонов из ядер и является оптимальной концентрацией кислоты, Для получения чистых ядер проводят трехкратную отмывку в буферном растворе, поскольку при двухкратной отмывке в них еще присутствуют загрязняющие факторы, например липиды.

Четырехкратная промывка только усложняет способ и не дает улуч40 шения качества ядер.

Для упрощения способа и возможности применения его в промышленных . масштабах в качестве растворителя использован нетоксический детер4 гент — додецилсульфат. натрия.

Измерение количества краски по поглощению при длине волны 590 ммк обусловлено тем, что при этой дли- не волны находится максимум погло 0 щения использованного красителя— кумасси голубого R --250.

Количество же и набор реагентов выбраны исходя из требований нормального протекания всех процес55. сов, а также потому, что при отмыв.ке ядер необходимо использовать десятикратный объем буфера по отношению к объему ядер.

Пример 1, Исследовали сперматозоиды белого амура, которые получали у половозрелых самцов в период нереста при индуцирований созревания спермы гормональными инъекциями. Сперму отбирали после1 инъекции и фиксировали в этиловом спирте, после. чего проводили выделение ядер, для чего сперматозоиды гомогенизировали в буферном растворе, содержащем 0,25 М сахарозы, 10 мМ трис-HCf, рН 7,5, 10 мМ МяС1, 25 мМ КС1 и 25 мМ

Жа Я О . Гомогенат центрифугировали при 3000 g 15 мин, осадок обрабатывали 0,5Х-ным тритоном

Х-100 в буферном растворе и затем отмывали от тритона Х-100 трехкратной промывкой ядер в буферном растворе. Затем ядра заливали

0,4 н. HCf и экстрагировали гистонь1 в течение 4 ч при 4 С. После о центрифугирования при 3000 д супернатант заливали трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 18Х. Гистоны осаждали в течение 24 ч при 4 С, затем осадок о собирали центрифугированием, промывали один раз подкисленным (0,25 н. НС1) ацетоном и трижды— чистым ацетоном, после чего гистоны высушивали под вакуумом.

Злектрофорез проводили в 15Х-ном полнакриламидном геле, содержащем 0,1Х додецилсульфата натрия.

Гели окрашивали красителем ;

0,1Ж-ным кумасси голубым !! -250 (электрофореграмма, г)

Полосы, соответствующие субфракциям гистона Н! и Hl вырезали и помещали в lX-ный додецилсульфат натрия. Инкубацню проводили в течение 24 ч при 37 С. Затем измеряли поглощение проб с элюировавшей краской при 9=590. Краситель пропорционально связывается с гистонами, поэтому по отношению концентрации краски, элюировавшей нз полос, содержащих субфракции Hl! и

Нl, судят о соотношении концентрации белков в этих субфракциях.

В данном случае соотношение

Hl,/Н1 равно 3:l, и сперматозоиды были отнесены к зрелым.

Ниже приведено соотношение субфракций Н1

Сперматозоиды 3:1

Зрелые семенники 2:l

1200869 4

Незрелые семенники 1,4:1

Печень 1:2

При проверке полученной после 1 инъекции пробы спермы по известной методике было установлено, что она содержит большое количество зрелых

I сперматозоидов с нормальной подвижностью — бб с.

Пример 2. Аналогично примеру !

О исследуют пробу спермы, полученную после 11 инъекции гормоном, стимулирующим созревание.

После исследования соотношения субфракции гнстонов Hl< /Hlg установ15 лено, что оно соответствует 2:1 (электрофореграмма, bj.

Такие сперматозоиды относятся к незрелым, хотя они и получены из зрелых семенников.

2О Исследования по общепринятой методике подтвердили, что в этой пробе было увеличенное количество незрелых сперматозоидов с подЪ вижнастью 45 с. В пробе преобладали не зрелые сперматозоиды, а сперматиды, находящиеся на различных этапах созревания.

Пример 3. Аналогично примеру исследуют пробу спермы после

ЗО ТТТ HHbeêöèè гормоном.

При исследовании было установлено, что соотношение субфракцнй гистонов Hl /Í1 составило 1,4:1 (электрофореграмма,Fj.

Исследования по общепринятой

5 методике показали, что в пробе содержатся незрелые половые продукты с подвижностью 33 с. Кроме . того, для контроля были исследоваО ны печень белого амура и гистоны тимуса теленка (электрофореграмма, а, д).

Значительное уменьшение соотношения Нl< /H12 в этих тканях по сравнению с половыми клетками подтверждает вывод о связи данныхсубфракций со сперматогенезом у карповых рыб.

Предлагаемый способ исключает субъективизм при определении степени зрелости половых продуктов самцов карповых рыб, поскольку он не зависит от погодных условий, как известный-способ определения степени зрелости по подвижности, а. также от опыта и физического состояния органов зрения наблюдателя.