Производные дульцита,обладающие ингибирующим действием в отношении злокачественных опухолей

 

Производные дульцита общей формулы CH2--eH-(JH-CJH-CH-CH2 о ОЯ1 OR2 и (I) . где Е и к ьС-СНгСН2.-ССЮН; ,-С-СН7.СН2С-ОСНз и 0 RZ -С-СН СНгСООН; . .« R.-C-СНз 0 йг-С-СН СН СООН; b N -С-СН2СН2СООН QD 4 0 00 R« -С-СН2СН2-СбН5, а со обладающие ингибирутцим действием в отношении злокачественных опухолей. SU.,,, 1194863 C5D4 С 07 D 303/16, 407/12, А 61 К 31/335 ТЕНИЯ /М

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР (21) 3437 77/23-04 (62) 3350453/23-04 (22) 18.05.82 (23) 03.11.81 (31) 2649/80 (32) 04.11.80 (33) HU (46) 30.11.85. Бюп. В 44 (71) Хиноин Дьедьсер Еш Ведьесети

Термекек Дьяра РТ (HU) (72) Илона Элекеш, Ласло Инштиториш, Кальман Медзихрадски, Ласло hsem

Хедвиг Медзихрадски, Каталин ди Глериа, Янош Шугар, Жуаанна ШомфаиРелле, Шандор Экхардт, Иван Хиди, Шандор Керпель-Фрониуш (HU) (53) 547.422.22-3! 717.03(088.8) (56) Патент Великобритании

М !490649, кл. С 07 D 303/!6, опублик. !977.

S.Somfai-Belle et a1 New derivatives of Dianhydrogalactitol (NSC-?32313) with significant antitumor activity. Proceedings of the

I0th International Congress of Chemotherapy, Washington, D..Ñ., 1978, . v. 2, р. !302-1304 ° (54) ПРОИЗВОДНЫЕ ДУЛЬЦИТА, ОБЛАДАЮЩИЕ ИНГИБИРУКЗЦИМ ДЕЙСТВИЕМ В OTHOHiEHHH ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫК ОПУХОЛЕЙ. авБ аи 1 486

СЮ 4 С 07 Р 303/16 407/12

А 61 К 31/335 (57) Производные дульцита общей формулы

CH2 — CH — СН- СН-СН вЂ” СН о ой! он 0 (), о

:где и и Í -C СН СН С00Н;

«о о

, -C — СН,СН С вЂ” О В о

R, -С вЂ” СН СН СООН; о

" — C CH3 о

u, — с- сн,сн,сюн; о

". -С вЂ” СКАН,СООН о

, — с — сн сн -с н, обладающие ингибирующнм действием в отношении злокачественных опухолей.

4863 2 щество. Полученное вещество перекрис. хейлизовывают из смеси диэтилового эфира и петролейного эфира с получением 1,0 г (96Х) 1,2-5,.6-диаигидро-3,4-бис-(P -карбоксипропионил) -дуль. цита (соединение С-2) т.пл. 138139ОС. При анализе методом тонкослойной хроматографии (Rf = 0,15 с использованием смеси (9:2) бензола и метаI0 иола и проявлением и -нитробензил" пиридином) продукт однороден.

Вычислено, Х: С 48,78; Н 5,73;

О 45,49.

С14 Ь щ 0 о (346,29)

15 Найдено, Х С 48,35; Н 5,25;

О 46,60.

Эквивалентная масса: Вычислено

173, Найдено, 180.

ИК-спектр: 3350 см (карбоксил), 1235 см (эпокси), бензильные и гидроксильные полосы отсутствуют.

Растворимость: соединение хорошо растворяется в спирте и тетрагидрофуране, плохо растворимо в диэтилог5 вом эфире и воде.

Пример 3. Получение 1 2-5, 6-диангидро-3- (p -карбоксипропионил);4-ацетилдульцита { соединение С-3) .

30 3 78 г (10 ммоль) 1,2-5,6-диангидро-3- (P -бензилоксикарбонилпропионил) -4-ацетилдульцит а гидрируют аналогично примеру 2 до прекращения отбора водорода. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в .вакууме и кристаллический остаток, перекристаллизовывают из смеси тетрагидрофурана и этилацетата. Получают 3,5 r (88 ) 1,2-5,6-диангидро-3- (-карбоксипропионил)-4-ацетил40 дульцита; т.пл, 134 С. По данным

О тонкослойиой хроматографии (Rf =

= 0,2 или 0,6, смесь (6:4) этилацетата и циклогексана или смесь (8:2} бензола и метанола, проявле45 ние п-нитробенэилпиридииом) продукт однороден.

Вычислено, : С 50,00; Н 5,59;

О 44,40

ll9

Пример I . Получение катализатора палладий-на-угле.

0,2 г хлористого палладия раство" ряют в 2 мл дистиллированной 5,7 г хлористо-водородной кислоты при нагревании раствор разбавляют пятикратно водой, затем добавляют 0,9 r активированного угля (Мерк), и суспензию кипятят в течение нескольких минут. Суспензию охлаждают и после этого подщелачивают (до рН9) с использованием 20Х-ного водного раствора гидроокиси натрия при встряхивании так, чтобы раствор над твердым, веществом стал совершенно бесцветным.

0,2 хлористого палладия растворяют в 2 мл дистиллированной 5,7 н хлористо-водородной кислоты при нагревании, раствор разбавляют 80 мл дистиллированной воды, и добавляют

9,0 г активированного угля (Иерк).

Результирующую суспенэию подщелачивают описанным выше путем.

Суспензии, полученные по методикам пунктов а) и б), смешивают, тщательно перемешивают и катализатор отфильтровывают, промывают до устранения хлоридов на фильтре, и после этого промывают с использованием

200 мл IХ-ного раствора уксусной кислоты. Мокрый катализатор сушат в эксикаторе над концентрированной сер-. ной кислотой.

Пример 2. Получение 1,2-5,6-диангидро-3,4-бис-(p-карбокси-:. пропионйл) -дульцита, I,b r (3 ммоль1

1,2-5,6-диангидро-3,4-бис-(P -бензилоксикарбонилпропионил)."дульцита растворяют в 150 мл сухого метанола, к раствору добавляют 0,3 r катализатора, полученного по методике примера 1, и полученную смесь гидрируют до отбора теоретического количества. водорода. На это требуется около 1,5 ч. . Катализатор отфильтровывают, раствор испаряют в вакууме, полученное белое кристаллическое вещество суспендируют в эфире, и отфильтровывают сухое веФ

Изобретение относится к новым химическим биологически активным соединениям ряда гекситов, конкретно к производным дульцита, обладающим ингибирующим действием в отношении злокачественных опухолей.

Цель изобретения - повышение терапевтической активности соединений ряда дульцита при снижении их токсичности»

С г HleОв (288,26)

Найдено, : С 49,48; Н 5 26;

О 44,70

Эквивалентная масса:

Вычислено, 288

Найдено 296, Пример 4. Получение I 2-5 6-диангидро-3-(P -карбоксипропионил)—

-4-(f -карбометоксипропионил)дульцита (соединение С-4} 4,50 г

119

LD для самца мыщи э мг/кг

Лекарст50 Т <о % крысы мг/кг

25,5

75

150

80 (10 ммоль) 1,2-5,6-диангйдро-Ç-(P — Д*н илоксикВрбонилпропиоНИЛ)

-4-(ф -карбометоксипропионил) -дульцита гидрируют аналогично примеру 2 до.отбора расчетного количества водорода. Катализатор отфильтровывают и растворитель отгоняют из фильтрата. Получают 3,1 г (86Z) кристаллического 1,2-5,6-диангидро-3-((3—

-карбоксипропионил)-4- (P -карбометоксипропионил) -дульцита, т.пл. 87890С. По данным тонкослойной хроматографии (Rf =. 0,25 или 0,4, смесь (6:4 ) этилацетата и циклогексана, нли смесь 8:2 бензола и метанола продукт однороден.

Вычислено, 7.: С 49,72; Н 6,12;

О 44 14.

С 1% Н зо01о (362, 4 )

Найдено, 7.: С 49,87; Н 5,39;

0 43,91

Эквивалентная масса:

Вычислено 362

Найдено 363

Пример 5. Получение 1,2-5 6-диангидро-3-(-карбоксипропионил)—

-4-(P ;- фенилпропионил)-дульцита (соединение С-5).

4,68 г (10 ммоль) 1,2-5,6-диан- гидро-3-((3 -бензилоксикарбонилпропионил)-4-(/3 -фенилпропионил) -дульцита гидрируют аналогично примеру 2.

Катализатор отфильтровывают и растворитель отгоняют от фильтрата с получением 3,3 г (847.) кристаллического 1,2-5,6-диангидро-З-((3 -карбоксипройионил)-4-(P -фенилпропионил/дульцита, т.пл. 80 С. По данным тонкослойной хроматографии {Rf = 0,3 или 0,7, смесь 6:4 этилацетата и циклогексана, или смесь 8:2 бензола и метанола) продукт однороден.

Вычислено, Ж: С 60,31; Н 5,86;

0 33,83

С 19 НггОВ

Найдено, X: С 60 60; Н 5,49;

0 34,50

Эквивалентная масса:

Вычислено 378

Найдено 390.

Новые производные дульцита (соединения С-2, С-З, С-4 и С-5) были подвергнуты биологическим исследованиям. Их биологическую активность сравнивали с активностью близких структурных аналогов:

Соединение А- 1,2-5,6-диангидроч

-3,4-диацетилдульгитол; соединение

4863 4

 — 1,2-5,6-диангидро-3,4-бис-(p. . -карбометоксипропионил) -дульцитол; соединение С - 1,2-5,6-диангидро

-3; 4-бис- (P -фенилпропионил) -дуль5 цитол;

Были осуществлены следующие исследования: усвоение энэима; тест на токсичность; определение доэовой зависимости ингибирования роста опу"

10 холи, гематоксичности и летальных эффектов для близких соединений, полученной отдельно на одинаковых моделях; терапевтические индексы, полученные на различных твердых, cnof5 собных к трансплантации опухолях грызунов; ингибнрование роста опухоли в твердой системе Саркома !80; влияние отдельной и повторяемых инъекций; мутагенность.

20 Получены следующие экспериментальные разультаты.

Усвоение энзима.

Соединение В пытались превратить в соединение С-2 с помощью энзим25 ного гидролиза при следующих условиях:

Время: 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 24,0 ч; температура 37ОС; буфер

1/15 И фосфат; энзим: химотрипсин, З0 трипсин, ацилаза l, ацилаза П.

Согласно оценке при вышеуказан» ных условиях все сложноэфирные связи соединения В расщепляются с одинаковой скороетью. Следовательно, метиловый эфир не может быть селективно разложен и трансформирован в кислотную форму.

1 I

СН вЂ” 0+C0 — CH С+ ()СН ю

О

Т аблица 1

Острая токсичность, Результаты исследований острой токсичности новых производных дульцита т

Ъ

5,1194863 d

Продолжение табл.1 Было найдено, что соединение С-2 наименее токсично иэ всех близких по структуре соединений как для ьышей, так и для крыс (табл. 1) .

LD для

40 у. крысы мг/кг

LD для самца мыши, мг/кг

Лекарст. во

190

660

С-2

105

180

С"3

126

235

С-4

146

210

С-5

Т аб лица 2

Дозовая зависимость ингибирования роста опухоли, гематоксичности и летальных эффектов новых производных дульцита

Белые лимфоциты крови

ЕВ,>, Лимфоциты, мг/кг

Белые гранулоциты крови

ED

Грану лоциты мг/кг

Токсич» ность

LD p мг/кг

Терапевтический индекс

Що W/

9о

Индекс безопасности

Е>уо

Лимфоциты, XEDpW

Ингибирование опухоли,имплан тироваиной по Walkeny

EDqp W, мг/кг

Лекарство

25,5

8 5 17 10

7 4 33 25

6 4 45 28

5,6

В

1,3

12,5

3,6

П р и м е ч а н и е: LD

Swiss весом 2731 г.После одной инъекции группа из 6 мышей при одной дозе была прослежена в течение 21 дня.

LD

Wistar Walker, больных раком.

Инъекции лекарства давали че" реэ 24 ч после тр ан сплант ации опухоли группе из 6 крьш и вели наблюдения в теч ение 1 0 дней

Дозовая зависимость ингибирования роста опухоли, гематоксичности и летальных эффектов для близких соединений, полученная отдельно на оди1О иаковых моделях.

Метод. Самцам крысы Wistar лекарства быпи введены через 24 ч после заражения 2х10 клетками Walker.

Эффективность определяли по дозам, вызывающим 50Х-ное ингибирование опухоли при взвешивании на десятый день, Дозы, приводящие к 50Х-ному уменьшению гранулоцитов, оцененных на четвертый день, служили в качестве основы для сравнения гематоксичности. Отношение минимальной летальной дозы (LD 1p) к минимальной эффективной до25 эе (MED=ED ) рассматривали как терапевтический индекс.

Согласно данным табл.2 как было найдено, соединение С-2 активно против опухоли в такой же доэовой обласЗО ти, как производные близких по структуре соединений А, В и С/ED p = l317 ммоль(кг); в то время как соединение С-2 более чем в два раза менее токсично, чем все другие вещества, 35 укаэанные здесь; следовательно, терапевтический индекс С-2 в два раза более предпочтителен, чем индекс любого другого члена групйы.

1! 94863

Продолхение табл. 2

Токсич ность

Жо мг/кг

Лекарство

Il0 20

35 10

50 18

70 25

190

5,0

С-2

6,4!

105

С-3

8,.8

С-4

126

5,7

8,2

146

С-5

8,5

%

Терапевтический индекс относительно соединения А1::н С-2.

Результаты исследованиятерапевтнческих индексов новых соединенийна раI зличных твердых,способныхк трансплантации опухолейгрызунов,даны в табл.З.

Таблица 3

Терапевтические индексы, полученные на различных твердых трансплантируеиах опухолях грызунов

180х8 интрперитонально

ЬВ /ЕВ

Интраперитонально LD ЕО /

/ED

Терапевтический индекс

МН)/ED

Иеланома х !4

Лекарство, интрпериторально NTD/

/ÅD ко

2,3 {3,4) 15,7 о){13) 4,3

8,5

1,9

7,4

8,0

3 5

6,4

6,5

2,6

1,9

С-2

132

38

4,8 . 5,0

-5,0

С-3

19

3,8

17,8

2 ° 5

С-4

22

15,2

4,0

С-5

16,З

П р и м е ч а н и е: Величины, фнгурирукщие в скобках, являются опубликованными величинами, но они были модифицированы sa счет повторения экспериментов.

Ингибирование роста опухоли в твердо Метод. Небольшие образцы твердой дой системе. Саркомы 180 были инокулированы на коСаркома 180: влияние отдельной и ау самца маши Swiss. Интраперитональповторяемах инъекций. ное применение лекарства к группе тирование по

Walkегу

И) о W/

/ЕВоо

Ингибирование опухоли, имплан тированной по Walkeny о 1 1

Терапевтический индекс

Жо /

/жэ„м т

Белые лимфоциты крови

ED

Лнмфоциты, мг/кг

Белые грану лоциты крови

ED î

Гранулоциты мг/кг

Индекс безопасности

EDfo

Лимфоциты, XEDOW

9 1194863 lO из шести животных начали на следую- удdJleHbl для оценки, Результаты предщий день, на 11-й день опухоли были ставлены в табл. 4.

Таблица4

Ингибирование роста опухоли в системе саркома 180

Иньек- ED о МТР, LDqo /ED so MTD/ED so ции мг/кг мг/кг

Лекарство

2,4

4,6

8,7

6,7

5,4

В

16,4

400

С-2

4,3

15,7

2,3

4,5

8,0

9,3

6,5

4,8

50

10,5

С-2

2,5

25

С-3

4,0

15,2

15

С-4

4,1

16,3

l2,9

С-5

Отсутствие мутагенности соединения С-2 в анализе салмонелла/микросома.

Мутагенность соединений А, В и

С представлена в табл. 5 и 6.

Все.испытуемые производные алкилирующих сахарных спиртов, эа исклю- 35 чением С-2 были мутагенны в штаммах

ТА 1535 и ТА 100 по результатам анализа салмонелла/ микросома. Данные относительно мутагенных и токсичных эффектов 1, б-дибром-дулцитола, 40

1,2-5,6-диангидро-дулцитола, 1-бром-3,6-ангидро-дулцитола и 1,2-эпокси-3 6-ангидро-дулцитола из1 ве стны и описаны.

Даже с использованием микросом- 45

Hblx sHsHMoB> полученных не только из печени крысы, но также иэ легкого крысы, почки мыши или печени хомяка, соединение С-2 не проявляет мутагенности к штаммам ТА 1535 и ТА IOO. Соединение С-2 также не проявляло мутагенности к штаммам TA 1537, ТА 1538 И ТА 98, в присутствии или отсутствии смеси 8-9, полученной иэ печени крысы.

) 194863

Таблица

Отсутствие иутагеиностн соединения С-2 в итаииах TA-1535 и TA 100

lkrmea TA ЙО ф(единее иие С-2, la плес тинке

Игами TA 1535

+0-9 сиесь

S-9 смесь еб-9 сиесь PCB месь си Ньаь Хомяк Хриси I6aa легкое очка печень чень печень легкое почка пе

Коняк мчав

17 (15) !

2 (12) 233

33 . 25 IÇ 160 !56 27Ь 252 !55

4l 27 26 19 171 IÝ7 249 213 !40г

105

2 l3

27 26 15 190 133 256 222 150

ЭЗ

35 25 22 154 142 264 190 131

51 32 43 . 160 71 26S 273 146

255

42 йепреуивно (споиуи o) 26

19 (! 6) 44 36 24 17 149 150 250 2S I

2!4

165х е

Данине в скобках ноиучени после предварительной инкубации (5 сивсь+бактерниЕС 2 ва искли" чеииеи верхней части агара) в течение 30 инн прн 37 С.

Таблица 6

Мутагенность соединений А и В

Лекарст- Концентрация во мк/г/пластинка

Ревераит/пластинка штамм

ТА 100

-S-9 +S-9 смесь сиеcb

1истидин+

BIT амм

ТП 1535

-S-9-смесь

+S-9 смесь

19

226

211

100

47

382

185

1000

227

10000

199

19

CIIOHT SHHO

l 76

240

193

l 00

1000

219

31 токсично

)0000

CllOHT 3HHO

Согласно эксперименту соединение С-2 оказалось немутагенным.

Это иллюстрируется тем фактом, что концентрация соединения С-2

55 вплоть до 10 мк/г,/пластинка не уменьшает числа бактериальных клеток, произрастающих в нормальной среде.! 277

l0 .32

100 2Ь

1000. 30

10000 31

13(! 7)

19 (! 4)

36 (ZS) lOll 788

1232 1253

318 217

Составитель Н.Капитанова

Редактор Ю.Середа Техред M.11àðoöaé Корректор Г. Решетник

Заказ 7381/29 Тираж 383 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

13 11

Однако соединение В вызывает 1014-кратное увеличение числа бактериальных клеток, произрастающих в нормальной среде.

С другой стороны, соединение В вызывает 10-14-кратное увеличение числа реверантиых"пластинок, в то время как высокая концентрация

10 мк/г,/пластинка„ как было най е Ф дено, является"токСйчной. ,Сравнение токсикологических свойств и фармакологических данных и мутагенности "," экспериментов по усовению .знзимов показывает, что наличие свободных карбоксильных групп в соединениях С-2, С-З, С-4 и С-5. позволяет им проявлять такие биологические свойства, которыми не обладают молекулы,не содержащие свободных карбоксильных групп.

Характеристические данные противоопухолевой активности соединений

А В и С, оценные на трансплантированных опухолях, являются существенка менее предпочтительными по сравнению с характеристическими данными соединений С-2, С-3, С-4 и С-5, содержащих свободную карбоксильную группу.

Терапевтические индексы соединения В, содержащего две карбоксигруппы, являются также менее предпочтительными по сравнению с такими же свойствами соединений С-2, С-3, С-4 и С-5. Иэ этого можно предположить, что карбометоксипропионильная группа, замещающая 1,2-5,6-диангидро-дулцитол (DAD) в 3 и/или 4 положения не вызывает увеличения тера-певтической активности, как свободные карбоксильные группы, замещающие

DAD в таких же положениях..

Отсутствие мутагенности в случае соединения С-2, содержащего свобод94863 14 ные карбоксильные группы, в противоположность другим мутагенным производным бифункционального гексита, особенно соединения В, содержащего две карбометоксигруппы, показывает, что присутствие карбоксильной группы вносит существенные изменения в биологическую активность °

Энзимная система живого органа не

10 способна к трансформации соедиения В в соединение С-.2, содержащее свободную карбоксильную группу, следовательно, соединение В не может рассматриваться как предшественник со15 единения С-2. Это иллюстрируется не только существенным биологическим .различием, но также включенными здесь результатами экспериментов по усвоению энзимов

Терапевтическая активность соединения А, содержащего две ацетильные группы, существенно ниже терапевтической активности соединения С-4, 25 содержащего не только ацетильную, но также и карбоксильную группу.

Соединение С, содержащее две фенилпропионильные группы, обладает менее предпочтительной терапевтичес30 кой активностью, чем соединенйе С-5, имеющее одну /3 -фенилпропионильную и одну свободную карбоксильную группу.

Предпочтительный терапевтический индекс соединений С-2, С-3 С-4 и

С-5 проявляется в. результате существенного уменьшения токсичности, которая связана с наличием свободных карбоксильных групп. Терапевтический индекс соединений. С-2, С-З, С-4 и С-5 в 8-15 раз лучше, чем терапевтический индекс соединений А, В и С, что является неожиданным и непрогнозируемым для соединений подобной структуры.