Способ выделения ферредоксина

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФЕРРЕДОКСИНА путем гомогенизации растительного сырья, экстракции белков трис-буфером, отжима, ступенчатого высаливания сульфатом аммония, центрифугирования, суспендирования, обессоливания на сефадексе g 50, хроматографии на ДЭАЭ-целлюлоза с элюцией хлористым натрием и последующей гельфильтрации на сефадексе g 50, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода и степени очистки целевого продукта, в качестве источника сырья используют листрья кукурузы на стадии образования початков, в трис-буфер добавляют аскорбат натрия 5-7 г/л, диэтилдитиокарбамат натрия 0,40 ,6 г/л и поливинилпирролидон 2-3 г/л, а элюцию проводят 0,15-0,18 М хлористым натрием.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ABTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3666444/28-14 (22) 20. 10. 83 (46) 30.11.85. Бюл. У 44 (71) Институт почвоведения и фотосинтеза AH СССР (72) Н.Ф. Незнайко (53) 541 ° 144.7(088.8) (56) Мухин Е.Н., Акулова Е.А., Гинс В.К. Методы выделения и исследования белков-компонентов фотосинтетического аппарата. Пущино, 1973. (54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРРЕДОКСИНА путем гомогенизации растительного сырья, экстракции белков трис-буфером, отжима, ступенчатого высаливания сульфатом аммония, „„SU„„1194422 А g 4 А 61 К 35/78 центрифугирования, суспендирования, обессоливания на сефадексе g = 50, хроматографии на ДЭАЭ-целлюлоза с элюцией хлористым натрием и последующей гельфильтрации на сефадексе

g = 50, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода и степени очистки целевого продукта, в качестве источника сырья используют листья кукурузы на стадии образования початков, в трис-буфер добавляют аскорбат натрия 5-7 г/л, диэтилдитиокарбамат натрия 0,40,6 г/л и поливинилпирролидон 2-3 г/л, а элюцию проводят 0,15-0,18 M хлористым натрием.

Изобретение относится к биохимии фотосинтеза, а именно к способам выделения белков, играющих ключевую роль в окислительно-восстановительных процессах при фотосинтезе, и может быть использовано для биохимичес-. ких исследований.

Цель изобретения — повышение выхода и степени очистки целевого продукта.

Пример. 1 кг листьев кукурузы, срезанных на стадии образования початков и хранившихся при

-30, заливают жидким йэотом, мео ханически размельчают в двухслойном бязевом мешке, заливают 1,3 л

0,005 М HCf буфером с защитными добавками, r:

Аскорбат н атрия 5,3

Диэтилдитиокарбамат, 0,5 (1000 мл)

Поливинилпирролидон 2 5

Экстракт отжимают. К 1,5 л экстракта добавляют 495 г сульфата амI мония марки х.ч. или о.с.ч. Через

0,5 ч центрифугируют в течение

30 мин при 5000 об/мин. Осадок отбрасывают, а к 1,8 л супернатанта добавляют 450 г сульфата аммония.

Через 1,5-2 ч производят центрифугирование как и в первом. случае.

Ферредоксин (Фд), находящийся в осадке, растворяют в 75 мл 0,05 И трис

НС3 буфера, рН 7.8. При 14000 об/мин в течение 10 мин центрифугированием освобождают раствор белка от неР астворившихся примесей. Для обессоливания наносят прозрачный раствор неочищенного Фд на предварительно уравновешенную 0,005 И трис HCt буфером, рН 7,8 колонку с сефадексом

С-50 средний (диаметр 2 см, высота

75 см), окрашенный в коричневый

94422 2 цвет Фд вместе с пластоцианином собирают отд льной фракцией. Наносят ее на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, (диаметр 2,5 см, высота 7 см), предварительно уравновешенную 0,17 M трис. НС7 буфером рН 7,8 с 0,08 M

NaCf Последовательно промывают колонку 0,05 М трис НС буфером:

0,17 И трис HCf буфером с 0,08 М NaCf

1О (элюируется пластоцианин), О, i7 И трис НС7 буфером с 0,18 M NaCt (элюируется Фд).

Окрашенный в синий цвет при добавлении феррицианида калия пласто15 цианин концентрируют на ДЭАЭ-целлюлозе (диаметр 1 см, высота 2,5 см), предварительно понизив ионную силу раствора раэбавлением 0,005 М трис HCf буфером в 2-3 раза.

20 Элюат Фд, окрашенный в коричневый цвет, концентрируют на ДЭАЭцеллюлозе (диаметр колонки 1 см, высота 2 см). Снимают концентрированный Фд 0,17 M трис НС буфером

25 с 0,55 M NaCt. Хроматографией на сефадексе G-50 сверхтонкий существенно очищают от примесей белков и сопутствующей .бурой окраски. Повторная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

ЗО и сефадексе G-50 сверхтонкий позволяет получить Фд с предельным ко- . эффициентом 4 0,44 служащим 4

1 гц8 критерием чистоты для Фд кукурузы.

Препаративный форез после 1. †.й

G-50 сверхтонкий позволяет получить белок с 0,44 красно-коричневого

A 412

4Г8 цвета. Выход белка при этом 45 мг.

40 Схематически выделение и очистку

Фд можно представить следующим образом.

Схема получения .ферредоксина кукурузы из листьев 12-недельных растений:

1194422

1. Гомогенизация.

2. Экстракция.

3. Отжим.

4. Ступенчатое высаливание.

5. Центрифугирование.

6. Ресуспендирование.

7. Обессоливание. — целлюлоза (ДЭАЗ-Ц)

0,17 И трис HCf

0,18 М NaCf

7. 0-50

ДЭАЗ

0,17 И трис HCf

0,08 М NaCg

ДЭАЭ-ц — пластоцианин

Фд ДЭАЗ вЂ” ц концентрационная .0,017 M трис HCf

0,55 И NaCt

С вЂ” 50 сверхт.

Д .ЭАЭ-ц

0,17 И трис Hc3

0,18 NaC7

ДЭАЭ-ц концентрационная

0,17 И трис НС7

0,55 M NaCt

G-50 сверхтонкий

Составитель Н.Гуляева

Редактор Т.Иитейко ТехредО.Неце Корректор, М. Самборская

Заказ 7342/7

Тираж 7.21 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5.

Филиал ППП "Йатент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Все процедуры очистки. можно проводить при комнатной температуре.

Выделенный таким способом Фд сохраняет устойчивость в течение 2-3 лет.

Выделение Фд из листьев кукурузы на стадии образования початков по той же схеме, что и в при35 мере 1, но без защитных добавок снижает выход белка в 1,5-2 раза.