Способ определения активности антитромбина- @ в плазме крови при гепаринотерапии

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИТРОМБИНА-lil В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПРИ ГЕПАРИНОТЕРАПИИ путем получения бедной .тромбоцитами плазмы, дефибринации ее, инкубации с тромбином при 36-38 С и определения активности антитромбина-Ш по времени свертывания, отличающийся тем, что, с целью повьпиения точности способа, инкубацию с тромбином проводят в течение 20-30мин, затем повторно инкубируют смесь в течение .10-15 мин при 60-65 С, далее добавляют раствор яда многочешуйчатой эфы в концентрации 5-10 - 2-10 г/л. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СДЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

y(r " 1р р ц

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ l3," Ц

ЬКЫ й(: l.;

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3711065/28-13 (22) 13.03.84 (46) 23.11.85. Бюл. № 43 (71) Алтайский государственный институт им. Ленинского комсомола (72) К.M.Áèmåâñêèé и И.В.Тамарин (53) 612.115.2(088.8) (56) Abildgaard U., Gravem К., Godal Н.С. "Assay of progressive

autithrombin in plasma". — Thrombos

diathes haemorrh; 1970, v. 24, № 1/2, р. 224-229.

Keimburger, Karger Н.Е. "Autithrombin III: Bestimung im Schusltest. — Laboratoriumsb1atter, 1978, 28, № 2, р. 65-70.

„„SU„„1193587 A дп 4 G 01 N 33/86 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИТРОМБИНА-III В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПРИ ГЕПАРИНОТЕРАПИИ путем получения бедной тромбоцитами плазмы, дефибринации ее, инкубации с тромбином при 36-38 С и определения активо ности антитромбина-III IIO времени свертывания, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, инкубацию с тромбином проводят в течение 20-30 мин, затем повторно инкубируют смесь в течение

10-15 мин при 60-65 С, далее добавляо ют раствор яда многочешуйчатой эфы в концентрации 5 ° 10 - 2 -10 1 г/л.

1193587

5 !

О

35

Изобретение относится к области медицины, в частности может быть использовано при лабораторной диагностике нарушений свертываемости крови при лечении больных с тромбофилиями, тромбозами, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови, находящихся на гепаринотерапии.

Цель изобретения: — повышение точности способа.

Пример. Приготавливают рабочие растворы тромбина, фибриногена и яда многочешуйчатой эфы..Рабочий раствор тромбина готовят непос-. редственно перед исследованием, так как в разведенном состоянии он быстро теряет свою коагулирующую активность. Тромбин разводят в буфере

Михаэлиса и его активность доводится до 6-8 с. Активность тромбина тестируется на растворе фибриногена так, чтобы О,1 мл тромбина свертывал 0,1 мл рабочего раствора фиб-. риногена за 6-8 с °

Для приготовления рабочего раствора фибриногена сухой фибриноген растворяют в буфере Михаэлиса до концентрации 0,67. По методу P.Рутберг определяют содержание коагулирующего белка и вновь добавляют буфер

Михаэлиса с таким расчетом, чтобы концентрация коагулирующего.белка была в пределах 0,35-0,4Х.

Для приготовления рабочего рас".вора яда многочешуйчатой эфы (Echis

multisguamatus) 1 мл яда растворяют в 10 мл буфера. Михаэлиса, (маточный раствор). Из маточного раствора последовательными разведениями получают раствор, дающий коагуляцию смеси плазм здоровых доноров в системе

0,1 мл плазмы + 0,1 мп раствора яда эфы за 20 5 с. Такая концентрация, как 5 -10 2 — 2 .10 " г/л, давала необходимую коагулирующую активность. Для исследования использовали образцы сухого яда из серпентариев

Средней Азии.

Затем из вены обследуемого силиконированной иглой берут кровь (0,5 мл сливают) и смешивают ее в силиконированной пробирке с 3,8 ным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, центрифугируют при

500 g в течение 6 мин. Снимают бога- тую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют ее в силиконированной пробирке при 1600 в течение

20 мин. 0,5 мп бедной тромбоцитами плазмы прогревают на водяной бане при 56 С в течение 5 мин. После прогревания. фибриноген осаждают центрифугированием при 1600 в течение

10 мин.

В силиконированную пробирку набирают 0,1 MJI дефибринированной исследуемой плазмы и 1,0 мл рабочего раствора тромбина.Смесь инкубируют на водяной бане в течение 30 мин при

37 С для полного связывания AT-Ш тромбином. Затем дополнительно прогревают в течение 10 мин при

60-65 С, при этом происходит инактивация протромбина иизбытка тромбина, и термостабильные комплексы

"AT-Ш-Т" не разрушаются. о

Далее смесь охлаждают до 37 С на водяной бане. После чего в про— бирку с 0,1 мл исследуемой смеси добавляют 0,1 мл рабочего раствора яда многочешуйчатой эфы. Смесь инкубируют на водяной бане в течение

2 мин при 37 С, добавляют в пробирку 0,1 мл рабочего раствора фибри ногена и регистрируют время свертывания. По калибровочной кривой находят процентное содержание активности антитромбина-Ш в плазме крови.

Калибровочную кривую строят, исследуя плазмы от 10 здоровых доноров, по следующему принципу. Цитратную донорскую плазму дефибринируют по описанной методике, после чего все образцы смешивают в равных объемах. Затем полученную смесь разводят буфером Михаэлиса в 2, 4, 8 и

16 раз, чем достигается концентрация AT-Ш соответственно 50, 25, 12,5 и 6,257. Определяют антитромбиновую активность каждого разве- . дения в секундах. Строят кривую разведения, где на оси абсцисс откладывают активность AT-Ш в про†. центах в соответствии с приготовленными разведениями, а на оси ординат время свертывания в секундах. Результаты исследования представлены в таблице..

1193587 4

Активность AT-Ш, определенная известным способом, 7.

98 102 160 260 Не определяется

Активность AT-Ш, определенная предлагаемым способсм, 7

98 95 96 98

Составитель Л.Шилина .Техред Ж.Кастелевич Корректор М.Демчик

Редактор А.Шандор

Заказ 7311/48 Тираж 896 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4

Концентрация гепарина, ед/мин 0,0 0,1 0,3 0 5 1 0 10,0