Способ идентификации фрагментов мембран хлоропластов
СПОСОБ ИДЕНтаФИКА1ЩИ ФРАГ-.. МЕНТОВ МЕМБРАН ХЛОР01ШАСТОВ, включающий фрагментирование мембран с помощью детергента, фракционирование и концентрирование анализируемых фрагментов, электронно-микроскопический анализ фракций, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения идентификации, сконцентрированные фрагменты промывают фосфатным буфером рН 7,0-8,0 для создания условий агрегации фрагментов мембран во вторичные мембраноподобные структуры , а идентификацию фрагментов осуществляют по присутствию на их поверхности частиц сопрягающего фактора.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
„„1193580
G 01 N 33/0
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, М АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3790277/30-15 (22) 19.06.84 (46) 23.11.85. Бюл. Ф 43 (71) Институт фотобиологии АН БССР (72) А.А. Шлык и M.Ñ. Радюк (53) 581.174.1(088.8) (56) Махер Г, Кордес Ю. Основы биоло гической химии. И.: Мир, 1970, Arutren С.7 °, DzИеу R.À. ,7. СеИ. Biof., 43, 16, 1969. (54) (57) СПОСОБ ИДЕНТЙФИКАЦИИ ФРАГ- ..
МЕНТОВ MEMBPAH ХЛОРОПЛАСТОВ, включающий фрагментирование мембран с помощью детергента, фракционированне и концентрирование анализируемых фрагментов, электронно-микроскопический анализ фракций, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения идентификации, сконцентрированные фрагменты промывают фосфатным буфером рН 7,0-8,0 для создания условий агрегации фрагментов мембран во вторичные мембраноподобные структуры, а идентификацию фрагментов осуществляют по присутствию на их поверхности частиц сопрягающего фактора.
1193580
Изобретение относится к фотобиологии, а именно к способам идентификации фрагментов мембран хлоропластов для установления их происхождения из межгранных или гранальных тилакоидов, и может быть использовано при изучении механизма фотосинтеза растений.
Цель изобретения — ускорение идентификации и повышение точности анализа фрагментов мембран хлоропластов.
Способ осуществляется следующим образом.
Изолированные хлоропласты из листьев растений фрагментируют с помощью детергентов (например, диги-. тонина, тритона Х-100 и т.д.). Материал фрагментированных мембран хлоропластов фракционируют, например, дифференциальным центрифугированием. Полученные, в данном случае, в виде осадков фракции фрагментов мембран промывают в течение .2-3 ч при 0-4 С 2-3 сменами чистого (без детергента) фосфатного буфера, рН 7,0-8,0, что является достаточным для практически полного. удаления детергента из осадка, тогда как однократная промывка недостаточна для этой цели.
После этого осадки фрагментов мембран фиксируют 1-3Х-ным раствором глютарового альдегида в течение 1-2 ч, постфиксируют 1-2Х-ным раствором 0 0r, тоже в течение
1-2 ч, после чего обрабатывают
0,5-1Х-ным раствором уранилацетата в течение 12- 16 ч. Обработанный таким образом материал обезвоживают спиртом и ацетоном и заключают в эпон. Срезы залитых в эпоновые блоки осадков контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца и просматривают под электронным микроскопом, устанавливая присутствие или отсутствие частиц сопрягающего фактора на поверхности вторичных мембраноподобных структур.
Пример 1. Изолированные хлоропласты ячменя, фрагментируют
-0,3Ж-ным раствором дигитонина в
0,02 М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 20 мин и фракционируют по.лученный материал с помощью дифференциального центрифугирования на фракции, осаждаемые при 20 тыс. в течение 30 мин, затем при
50 тыс. 1, в.течение 30 мин, при
100 тыс. Ч в течение 30 мин и при 144 тыс. q в течение 60 мин.
Полученные осадки промывают в течение 3 ч тремя сменами (по 10 мл) чистого фосфатного буфера. Все перечисленные операции проводят при
0-4 С. Отмытые от дигитонина осадо ки фиксируют 27-ным глютаровым альдегидом в течение 1 ч, постфиксируют 27-ным раствором О Оц тоже в течение 1 ч, затем обрабатывают
17.-ным раствором уранилацетата в течение 12 ч, обезвоживают спиртом и ацетоном и заключают в эпон. Срезы залитых в эпоновые блоки осадков прокрашивают 17.-ным раствором уранилацетата и цитратом свинца, после чего их просматривают и фотографируют на электронном микроскопе, устанавливая присутствие или отсутствие структурных элементов о диаметром 100 А на поверхности вторичных мембраноподобных структур.
Пример 2. Материал обрабатывают аналогично примеру 1 за исключением того, что полученные осадки промывают одной сменой фосфатного буфера. Этого недостаточно для формирования из фрагментов мембран четких мембраноподобных структур, т.е. на электронномикроскопических изображениях не видно четких мембраноподобных структур.
Пример 3. Материал обрабатывают таким же образом как в примере 1, за исключением того, что полученные осадки не промывают фосфатным буфером, а сразу фиксируют глютаровым альдегидом. В этом случае вторичные мембраноподобные структуры из фрагментов мембран хлоропластов не образуются.
Пример 4. Материал обрабатывают таким же образом как в примере 1, за исключением того, что полученные осадки промывают фосфатным буфером, рН которого не 7,2, а
7,0. При таких условиях имеет место образование вторичных мембраноподобных структур из фрагментов мембран хлоропластов.
Пример 5. Материал обрабатывают таким же образом как в примере 1, за исключением того, что полученные осадки промывают фосфатным буфером, рН которого 8,0. При таких условиях наблюдается образо1193580
Составитель М.Мирзаев
Техред С.Мигунова
Корректор М.Максимишинец
Редактор А.Шандор
Тираж 896 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Заказ 82 84
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 вание вторичных мембраноподобных структур, однако они имеют несколько нечеткий вид.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает достоверность анализа фракций и значительно облегчает его, так как позволяет определить исходную локализацию материапа фрагментированных мембран хлоропластов в нативных межгранных и гранальных тилакоидах при прямом визуальном наблюдении (или фотографировании) под электронным микроскопом.
Причем вместо характерного для
5 известного решения технически сложного и сравнительно редкодоступного во многих лабораториях приготовления препаратов криоскалыванием используют обычный метод ультратонких срезов.
