Способ получения коллагенового раствора для диагностики состояния тромбоцитов крови

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВОГО РАСТВОРА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ТРОМБОЦИТОВ КРОВИ, включающий промывку исходного сырья, обработку его ферментным препаратом, инактивацию фермента раствором щелочи и обработку органической кислотой с получением коллагенового раствора, отличающийся тем, что, с целью снижения латентного периода коллагенового раствора и повышения его тромбоцитоагрегирующей активности, в качестве ферментного препарата используют раствор аспергилпепсина с активностью 0,25-0,5 ед/мл, после инактивации фермента осуществляют выделение балластных веществ механическим путем, а полученный коллагеновый раствор нейтрализуют щелочью до рН 4,0-5,8.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИОАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИД=ТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3675853/28-13 (22) 21.12.83 (46) 15.05.85. Бюл. № 18 (72) П. М. Голованова, Л. P. Макарова, Н. Н. Тузова, Г, М. Язикова, К. М. Лакин, В. С. Ефимов, Н. В. Стрижова и Т. В. Первова (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт мясной промышленности (53) 668.391.29 (088.8) (56) Патент ФРГ № 1288237, кл. 29 в 1/10, 30.01.69, Авторское свидетельство СССР № 511062, кл. А 23 J 1/10, 7.06.74. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВОГО РАСТВОРА ДЛЯ ДИАГ„SU„„A

4с ц А 23 J 1 10; G 01 N 3348

НОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ТРОМБОЦИТОВ КРОВИ, включающий промывку исходного сырья, обработку его ферментным препаратом, инактивацию фермента раствором щелочи и обработку органической кислотой с получением коллагенового раствора, отличающийся тем, что, с целью снижения латентного периода коллагенового раствора и повышения его тромбоцитоагрегирующей активности, в качестве ферментного препарата используют раствор аспергилпепсина с активностью 0,25 — 0,5 ед/мл, после инактивации фермента осуществляют выделение балластных веществ механическим путем, а полученный коллагеновый раствор нейтрализуют щелочью до рН 4,0-5,8.

1 155227

Изобретение относится к технологии получения коллагеновых растворов, применяемых для диагностики состояния тромбоцитов крови, и может быть использовано в мясной промышленности.

Целью изобретения является снижение латентного периода коллагенового раствора и повышение его тромбоцитоагрегирующей активности.

Пример 1. Коллагенсодержащее сырье, в частности ахилловые сухожилия крупного рогатого скота, освобождают от околосухожильной сумки и промывают проточной водой 30 мин.

Промытое сырье в количестве 1 кг измельчают на мясорубке с диаметром решетки 1,6 мм и обрабатывают раствором фермента аспергилпепсина активностью 0,25 ед/мл рН 2,2, жидкостном коэффициенте

1:4 и температуре 20 С в течение 10 сут.

Далее проводят инактивацию фермента путем добавления 1 н. раствора едкого натрия, доводя рН раствора до 6,0 и осуществляют выдержку раствора 24 ч.

После инактивации механическим путем, в частности на центрифуге, раствор балластных веществ отделяют от коллагена и последний растворяют в 20 л 0,1 М раствора уксусной кислоты, фильтруют и проводят нейтрализацию 1О/О-ным раствором аммиака, доводя рН до 4,0.

Полученный коллагеновый раствор используют в качестве реагента для оценки агрегационной активности тромбоцитов крови от интактных кроликов. При этом раствор имеет следующие характеристики: продолжительность латентного периода (время от момента внесения образца коллагена до начала агрегации) составляет

5,5 мин, а тромбоцитоагрегирующая активность 47,3 /ц.

Пример 2. Коллагенсодержащее сырье, в частности дерму крупного рогатого скота, очищают, промывают, мездрят и снимают эпидермис.

Подготовленное сырье в количестве 1 кг промывают проточной водой и измельчают на мясорубке с диаметром решетки 2 мм.

Далее проводят обработку раствором фермента аспергилпепсина активностью

0,5 ед/мл при рН 2,7, жидкостном коэффициенте 1:3 и температуре 25 С в течение

6 сут. Инактивацию фермента осуществляют 1 н.раствором едкого натрия, доводя рН раствора до 6,5. При этом рН сырье выдерживают 20 ч.

После инактивации на центрифуге отделяют раствор балластных веществ от коллагена и последний растворяют в 30 л

0,2 М раствора уксусной кислоты. Полученный коллагеновый раствор фильтруют и

10 !

55 нейтрализуют 0,1 н. раствором едкого натрия, доводя рН до 4,9.

Коллагеновый раствор имеет следующие характеристики: продолжительность латентного периода 3,9 мин, тромбоцитоагрегирующая активность 41О/О.

Пример 3. Коллагенсодержащее сырье, например шкуру теленка, очищают, промывают, мездрят и снимают эпидермис.

Подготовленное сырье в количестве 1 кг промывают проточной водой 1 ч, измельчают на мясорубке с диаметром решетки 2 мм и обрабатывают раствором фермента аспергилпепсина активностью 0,5 ед/мл рН 3,2, жидкостном коэффициенте 1:3 и температуре 30 С в течение 4 сут.

Инактивацию фермента проводят 2н. раствором едкого натрия, доводя рН раствора до 7,0, выдержку при этом рН осуществляют в течение 18 ч и после выделения коллагена его растворяют в 30 л 0,1 М уксусной кислоты

Полученный коллагеновый раствор фильтруют и нейтрализуют 7О/О-ным раствором аммиака, доводя рН до 5,8.

Колл аге новый раствор имеет следующие характеристики: продолжительность латентного периода 3,4 мин, тромбоцитоагрегирующая активность 35,6 /О.

Пример 4. Коллагенсодержащее сырье, например дерму крупного рогатого скота, очищают, промывают, мездрят и снимают эпидермис.

Подготовленное сырье в количестве 1 кг промывают водой в течение 30 мин, измельчают на мясорубке с диаметром решетки

2,0 мм и обрабатывают раствором фермента аспергилпепсина активностью 0,5 ед/мл при рН 2,0, жидкостном коэффициенте 1:3 и температуре 18 С в течение 3 сут. Инактивацию проводят 1 н раствором едкого натрия, доводя рН раствора до 5,5 и выдерживают сырье при этом рН 24 ч.

Выделенный коллаген от раствора балластных веществ растворяют в 20 л 0,1 М уксусной кислоты, фильтруют и нейтрализуют 1О/ц-ным раствором аммиака, доводя рН до 35.

Полученный коллагеновый раствор имеет следующие характеристики: продолжительность латентного периода 9,6 мин, тромбоцитоагрегирующая активность 19,3О/О.

Очень низкие агрегационные свойства реагента связаны с эффектом дезамидирования, вызванного низкими значениями рН обработок.

Пример 5. Коллагенсодержащее сырье, например шкуру теленка, обрабатывают как в примере 4. Далее сырье промывают водой 30 мин, измельчают (как в примере 4) и обрабатывают раствором фермента аспергилпепсина активностью 0,25 ед/мл при рН

3,5, жидкостном, коэффициенте !:4 и температуре 32 С в течение 10 сут.

1155227

Составитель Г. Гаранина

Редактор Т. Митейко Техред И. Верес Корректор А. Обручар

Заказ 2933/4 Тираж 596 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )K — 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Инактивацию фермента проводят 1 н. раствором едкого натрия, доводя рН раствора до 7,5 выдержку при этом рН осуществляют в течение 24 ч, а выделенный коллаген .от раствора балластных веществ растворяют в 20 л 0,1 М уксусной кислоты.

Полученный коллагеновый раствор фильтруют и нейтрализуют 7о/о-ным раствором аммиака, доводя рН до 6,0.

Коллагеновый раствор находился в скоагулированном состоянии и не мог быть использован в качестве диагностического реагента.