Способ обнаружения и подсчета живых микроорганизмов в жидких средах

 

СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И ПОДСЧЕ ТА ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЖИДКИХ СРЕДАХ, включающий витальное окрашивание микроорганизмов красителем, облучение светом потока жидкой среды, регистрацию излучения под углом к направлению распространения облучающего света и обнаружение и подсчет микроорганизмов в жидкой среде по интенсивности регистрируемого излучения , отличающийся тем, что, с целью повышения избирательности обнаружения и подсчета живых микроорганизмов на фоне примесных частиц, в качестве красителя используют соли тетразолиев, a облучение 1 жидкой среды и регистрацию излучения СП С проводят в диапазоне длин волн от 680 до 740 нм.

СОЮЗ COBETCHHX

CCCCUICCC РР

РЕСПУБЛИК..SU„„

4,, 59 С 01 " 21/84

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1-:

К АВТОРСКОМУ СВКВВТВВВСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3633951/18-25 (22) 12.08.83 (46) 07.01.85. Бюл. Ф 1 (72) В.К.Яковлев, А.С.Юрченко, Л.АВшемякин. A.è.ïåòðîâ и:В.А.Якимов (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (53) 535.24(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

У 849858, кл. 5 01 N 21/61 1979.

2. M.À.Bonner Й.R.Hullett

R.G.Sweet, Ь.А.Hermenberg Piuorescence Activated Cell Sorting, Rev. Sci, (Instr. 1972, v. 43,, В 3, р. 404-409 (прототип).

- (54) (57) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И ПОДСЧЕ ТА ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЖИДКИХ

СРЕДАХ, включающий витальное окрашивание микроорганизмов красителем, облучение светом потока жидкой среды, регистрацию излучения под углом к направлению распространения облучающего света и обнаружение и подсчет микроорганизмов в жидкой среде по интенсивности регистрируемого излучения, отличающийся тем, . что, с целью повьнпения избирательности обнаружения и подсчета живыхмикроорганизмов на фоне примесных частиц, в качестве красителя используют соли тетразолиев, а облучение g жидкой среды и регистрацию излучения проводят в диапазоне длин волн от

680 до 740 нм.

11335

Ф

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для обнаружения и подсчета живыхмикробных клеток в жидких средах в ускоренном автоматизированном режиме.

Известен способ обнаружения живых микроорганизмов, включающий окрашивание живых микроорганизмов, облучение светом среды, содержащей микроорганизмы, и определение количества 1б живых микроорганизмов по интенсивности флюоресценции красителя на длине волны 580 нм (11 .

Однако регистрация полезного сигнала флуоресценции может быть резко зат- g руднена эа счет флуоресценции сонутствующих примесей, имеющих флюоресценцию в той же спектральной области. Это приводит к ошибкам в анализе, в ряде случаев делает его вообще невозмож- 2б ным.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ обнаружения и подсчета живых микроорганизмов в 25 жидких средах, включающий витальное окрашивание микроорганизмов красителем, облучение светом потока жидкой среды, регистрацию излучения под углом к направлению распространения

ЭО облучающего света, обнаружение и подсчет микроорганизмов в жидкой среде по интенсивности регистрируемого излучения (2j .

Однако известному способу присуща недостаточно высокая избирательность

3S обнаружения и подсчета живых микроорганизмов на фоне примесных частиц.

Целью изобретения является повышение избирательности обнаружения и подсчета живых микроорганизмов на фоне прнмесных частиц.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу обнаружения и подсчета живых микроорганизмов в жидких средах, включающему витальное окрашивание микроорганизмов красителем, облучение светом потока жидкой среды, регистрацию излучения под углом к направлению распространения облучающего света и обнаружение и подсчет микроорганизмов в жидкой среде по интенсивности регистрируемого излучения, в качестве красителя используют соли тетразолиев, а облучение жидкой среды и регистрацию излучения проводят в диапазо- 55 не длин волн от 680 до 740 нм.

Для осуществления данного способа могут быть использованы различные

18 2 устройства для. определения концентрации и дисперсного состава частиц в жидких средах.

Способ осуществляют следующим образом.

Микроорганизмы исследуемой порции жидкости подвергают непосредственно в пробе витальной окраске солью тетразолия, например МТТ-метилтиазолилтет" разолием бромида С ВН Вг И 5. Лля чего в пробу вносят с помощью дозатора 0,15Х-ный раствор соли, который готовят на фосфатном буфере Зеренсена в рН 8,2. Раствор соли вносят в пробу в соотношении 1:4 по объему, что является достаточным для витальной окраски микроорганизмов с исходной концентрацией 10 -10 клеток в 1мл. (о и

Избыток соли тетразолия не влияет на ход реакции витального окрашивания и не требует удаления (отмывки пробы).

Смесь перемешивают, прогревают

2-5 мин при 39-42 С и направляют

0 в проточную кювету устройства для определения дисперсного состава частиц в жидких средах.

Облучение жидкой среды и регистрацию издучения под углом к и правлению распространения облучающего света проводят в диапазоне длин волн 680740 нм.

В этих условиях интенсивность излучения от живых микроорганизмов, прошедших витальное окрашивание, значительно превышает интенсивность излучения от примесных частиц неорганической и органической природы.

Экспериментальную проверку способа проводили на различных жидких средах (физраствор, дистиллированная вода, водопроводная вода, натурные воды поверхностных водоемов и водостоков, сточная жидкость, смывные воды с поверхностей, концентрирующие жидкости импинджеров) с бактериальными нагрузками в диапазоне от единичных клеток в I мл до

10 - 10 I кл/мл.

Эксперименты проводили с помощью фотоэлектрического анализатора механических примесей ФС-112.

Как показали результаты экспериментов, использование предлагаемого способа позволяет повысить избирательность обнаружения и подсчета живых микроорганизмов в жидких средах.

Составитель Г. Коломейцев

Редактор А. Шишкина Техред А.Кикемезей Корректор Г. Огар

Заказ 9943/36 .

Подписное

Тираш 898

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ушгород, ул. Проектная, 4

3 1

Результаты подсчета микроорганизмов предлагаемым способом совпадали с результатами подсчета независимыми методами — путем подсчета окрашенных микроорганизмов в камере Горяева и методом посевов на твердые питательные среды по Коху, что указывает на

133518 4 достоверность измерений данным способом. !

Таким образом, предложенный спо5 соб позволяет увеличить избирательность обнаружения и подсчета KHBblx микроорганизмов.